抗菌大环肽揭示 BamA 独特抑制模式，为抗耐药菌研究开辟新径

《Nature Communications》：Antibacterial macrocyclic peptides reveal a distinct mode of BamA inhibition

抗生素耐药性严重威胁全球健康，针对革兰氏阴性菌的新型抗生素研发停滞。研究人员通过 mRNA 展示技术筛选与大肠杆菌 BamA 结合的环肽，发现 3 种环肽能抑制 BAM 缺陷菌株生长、阻断外膜蛋白（OMP）组装。该研究为开发新型抗生素提供了方向。

　　在当今的医疗领域，抗生素耐药性如同一场日益猖獗的 “超级细菌危机”，正以惊人的速度在全球蔓延，成为威胁人类健康的重大难题。世界卫生组织多次警示，自上世纪 60 年代以来，针对革兰氏阴性菌的新型抗生素一直未实现商业化。这使得耐药的革兰氏阴性菌在医院环境中肆意滋生，像大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等 ESKAPEE 病原体不断引发感染，给临床治疗带来极大挑战。

革兰氏阴性菌之所以难以攻克，是因为其拥有特殊的细胞结构。它们不仅有细胞质膜，还有一层外膜（OM）。这层外膜就像一道坚固的屏障，不仅能阻挡大分子和非极性化合物，还能抵御一些传统抗生素的攻击。外膜中存在着一种独特的外膜蛋白（OMP），其通过圆柱形两亲性 β- 折叠（“β- 桶”）结构跨膜，在细菌的生存和致病过程中发挥着关键作用。而 β- 桶组装机器（BAM）则负责 OMP 的组装（折叠和膜插入），其中 BamA 作为 BAM 的核心亚基，由于其结构和细胞表面定位保守，且催化的反应至关重要，成为极具潜力的抗菌靶点。尽管此前已有研究发现一些 BamA 抑制剂，但它们都存在各种缺陷，如靶向性差、作用机制不明确或合成困难等。

在这样的背景下，Merck & Co., Inc. 等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们利用 mRNA 展示技术，从庞大的环肽文库中筛选出与大肠杆菌 BamA 具有高亲和力的环肽。研究结果令人振奋，这些环肽不仅能抑制 BAM 缺陷的大肠杆菌菌株生长，还能在体内外抑制 OMP 的组装。更为重要的是，研究发现了这些环肽独特的作用机制，为开发新型抗生素提供了全新的思路。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为抗耐药菌研究领域带来了新的曙光。

研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。首先是 mRNA 展示技术，通过构建包含超过 10¹²种独特化合物的单环肽文库，筛选出与 BamA 结合的环肽。其次是表面等离子共振（SPR）技术，用于检测环肽与 BamA 的结合能力。此外，X 射线晶体学技术解析了环肽与 BamA 结合的晶体结构，分子动力学（MD）模拟则深入研究了环肽与 BamA 的相互作用及对其构象的影响。

研究结果如下：

• 环肽的筛选与特性：利用 PeptiDream Peptide Discovery Platform System（PDPS），通过多轮体外选择，从两个优化的文库中筛选出多个与 BamA β- 桶高亲和力结合的大环肽，最终选定 CP1、CP2 和 CP3 进行深入研究。SPR 实验表明，这三种环肽与大肠杆菌 BamA β- 桶的结合亲和力在纳摩尔级别，且不与铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的 BamA β- 桶结合，显示出其结合的特异性。
• 环肽的抗菌活性：在抗菌实验中，CP1、CP2 和 CP3 对野生型大肠杆菌生长无影响，但能抑制 BAM 活性受损的大肠杆菌菌株生长，如 JCM972 和 AM710，其最小抑菌浓度（MIC）在 6.3 - 12.5 μM 之间。同时，BamA 的 E470K 突变可抑制 CP2 和 CP3 的抗菌活性，这表明环肽的抗菌作用与它们和 BamA 的相互作用密切相关。
• 环肽的结合位点与机制：X 射线晶体学分析发现，CP1、CP2 和 CP3 均结合在 BamA β- 桶的腔内，且与已知抑制剂的结合位点不同。CP1 和 CP3 通过与 β- 桶两侧的残基相互作用密封侧向门，CP2 则主要结合在 β3 - 7 链，抑制 BamA 活性的方式可能是限制其 β- 桶的灵活性。MD 模拟显示，CP1 和 CP2 能稳定结合在 BamA 腔内，进一步证实了它们的作用机制。
• 对 OMP 组装的影响：体外实验中，CP1、CP2 和 CP3 在较低浓度下就能显著抑制 OMP 的组装，如 EspPΔ5′、OmpT 和 OmpC。在体内实验中，这些环肽同样能抑制 OMP 组装，但效果较体外实验稍弱。这表明环肽从周质侧进入 BamA β- 桶的效率可能高于细胞外侧。
• 对特殊突变体的作用：研究人员发现，CP1、CP2 和 CP3 在 EspP (G1123R) 突变体与 BAM 结合后添加，能加速其组装，而在结合前添加则抑制组装。这种现象与添加 EDTA 或山梨醇的效果相似，说明环肽可能通过促进 BamA 的某种构象变化，降低 OMP 插入的动力学障碍，从而加速组装。
• 对 BamA 构象的影响：MD 模拟显示，CP2 能促进 BamA 从开放状态向预关闭状态转变，CP1 虽不能直接促进开放状态的 BamA 关闭，但可能将其锁定在中间构象。这进一步支持了环肽通过影响 BamA 构象来加速 OMP 组装的观点。

研究结论和讨论部分指出，该研究成功利用 mRNA 展示技术筛选出具有抗菌活性的环肽，这些环肽通过一种全新的机制抑制 BAM 活性。它们与已知的 BamA 抑制剂作用机制不同，通过结合在 BamA β- 桶腔内，稳定其侧向关闭构象，阻止 OMP 的 β- 信号与 BamA β1 结合，同时促进 OMP 插入外膜的后续步骤。这一发现揭示了 BAM 介导的 OMP 组装过程中一个此前未被发现的步骤，即 BamA β- 桶部分关闭以促进 OMP 插入。虽然目前 CP1、CP2 和 CP3 在体内抑制 BamA 活性的浓度较高，但可以通过与桥接肽连接等方式提高其穿透外膜的能力，增强药效。此外，这种窄谱抗生素有望减少对共生微生物的损害，降低艰难梭菌感染等风险。该研究不仅为新型抗生素的研发提供了潜在的先导化合物，还为深入理解 BAM 介导的 OMP 组装机制提供了重要依据，推动了抗耐药菌领域的研究进展。