编辑推荐：
本文聚焦阿什韦尔 - 莫雷尔受体（AMR），通过基因糖工程手段研究其生理配体。利用肠道碱性磷酸酶（IAP），发现 AMR 不结合唾液酸化 IAP，且 IAP 单体二聚化可形成 AMR 配体，为理解 AMR 功能和配体调控提供关键依据。
### 研究背景
阿什韦尔 - 莫雷尔受体（AMR）是肝细胞表面的内吞型去唾液酸糖蛋白受体，在调控血液中数百种循环糖蛋白浓度方面发挥着重要作用，其功能与宿主对感染的反应及疾病发展密切相关。然而，关于 AMR 配体的组成和拓扑决定因素存在诸多争议。
早期研究表明，AMR 偏好结合去唾液酸化的三天线或更高分支结构的 N - 聚糖上的多价半乳糖，对双天线形式的半乳糖结合甚少。但循环血液中的糖蛋白大多修饰有双天线 N - 聚糖，这与 AMR 的配体偏好存在矛盾。同时，AMR 配体的唾液酸化状态也存在争议，有研究报道其可结合 α2 - 6 唾液酸化但不结合 α2 - 3 唾液酸化的糖型，而这些结论与多数循环糖蛋白的实际情况不符。
IAP 糖工程
哺乳动物肠道碱性磷酸酶（IAP）是一种抗炎酶，正常情况下其半衰期由 AMR 依赖的清除机制决定。在本研究中，研究人员通过细胞糖工程技术，利用 CRISPR/Cas9 和锌指核酸酶（ZFNs）对中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行基因编辑，靶向特定的糖基转移酶基因，构建了稳定表达不同 N - 聚糖分支和唾液酸化形式的重组人 IAP 的细胞系。
研究人员成功获得了紧密均一且实验可比的 IAP 糖型，包括末端带有 α2 - 3 或 α2 - 6 唾液酸连接的双天线糖型（IAP α2 - 3 Bi 和 IAP α2 - 6 Bi），以及带有 α2 - 3 唾液酸连接的双、三、四天线混合糖型（IAP α2 - 3 Multi）。通过多种分析手段对这些糖型进行表征，结果显示所有糖型的 IAP 均为二聚体，且具有相似的酶活性，其 N - 聚糖位点均被占据。
去唾液酸化 IAP 糖型的循环半衰期及对 AMR 功能的依赖
研究人员对比了去唾液酸化的双天线和多天线 IAP 糖型在野生型（WT）小鼠体内的循环半衰期。结果发现，去唾液酸化的 IAP α2 - 3 Multi 糖型清除速度极快，半衰期小于 1 分钟；而去唾液酸化的双天线 IAP 糖型清除速度相对较慢，半衰期约为 IAP α2 - 3 Multi 糖型的两倍。
进一步在 Asgr1?/?和 Asgr2?/?小鼠中研究发现，去唾液酸化的 IAP 糖型半衰期显著延长，增加了 200 多倍，且在 Asgr 缺陷小鼠中，双天线和多天线去唾液酸化 IAP 糖型的半衰期没有显著差异。这明确了 AMR 在决定去唾液酸化 IAP 糖型半衰期方面的关键作用，也表明多天线半乳糖的呈现形式对 AMR 依赖的清除速率有重要影响。
AMR 对 IAP 清除过程中 α2 - 3 和 α2 - 6 连接唾液酸的研究
研究人员探究了唾液酸化的双天线 IAP 糖型（α2 - 3 Bi 和 α2 - 6 Bi）在体内的半衰期。分别将这些糖型静脉注射到 WT、Asgr1?/?和 Asgr2?/?小鼠体内，测量 IAP 半衰期。结果显示，在所有基因型小鼠中，两种不同唾液酸化的 IAP 糖型的半衰期没有差异，这表明 AMR 不能有效结合和清除带有 α2 - 3 或 α2 - 6 唾液酸连接的双天线 N - 聚糖的 IAP 糖蛋白。
IAP 糖型与 AMR 的结合
通过对新鲜冷冻肝脏切片进行荧光标记 IAP 糖型的结合实验，研究人员发现，AMR 依赖的结合仅在去唾液酸化的 IAP 中观察到，且对去唾液酸化的 IAP α2 - 3 Multi 结合最强，而 α2 - 3 或 α2 - 6 唾液酸化的 IAP 糖型几乎没有显著结合。
在进一步的实验中，将 AMR 捕获在微孔板上，与不同的 IAP 糖型孵育，通过测量碱性磷酸酶（AP）活性来检测 IAP 的结合。结果表明，在滴定 IAP 浓度至 400 nM 时，只有去唾液酸化的 IAP 糖型能检测到与 AMR 的结合，唾液酸化的 IAP 糖型仅在高浓度下有少量结合，这可能是由于糖型制备过程中唾液酸化不完全导致。此外，通过膜吸附实验也进一步证实了 AMR 对唾液酸化 IAP 糖型的低结合能力。
模拟 IAP 糖型以检测 AMR 配体的构象和拓扑决定因素
通过对 IAP 糖型的分子模拟，研究人员发现，虽然去唾液酸化的双天线 N - 聚糖单体本身不太可能成为 AMR 配体，但在生理条件下，IAP 自发形成的二聚体可使双天线 N - 聚糖紧密并置，从而形成符合 AMR 结合要求的三价或更高价半乳糖连接，成为 AMR 配体。对于去唾液酸化的四天线 N - 聚糖的 IAP 糖型，模拟结果显示其所有 N - 聚糖位点都存在 AMR 配体。
讨论
本研究利用基因糖工程技术，生产了紧密均一的 IAP 糖型，解决了以往关于 AMR 配体组成、拓扑和范围的不一致报道。研究明确了 AMR 不结合或清除带有 α2 - 6 或 α2 - 3 唾液酸连接的 IAP 糖型，只结合去唾液酸化暴露多价半乳糖的 IAP 糖型。
同时，研究解释了双天线 N - 聚糖虽在循环糖蛋白中占主导，但通过糖蛋白单体的二聚化可形成 AMR 配体，这一发现扩展了对 AMR 配体库的理解。此外，研究还指出以往研究中存在的问题，如合成 N - 聚糖和新糖缀合物中唾液酸化不完全可能导致错误结论。
未来，进一步的建模和实验研究将有助于深入理解 AMR 介导的血液 N - 糖蛋白配体的结合和调控，为揭示这一典型哺乳动物内吞凝集素受体的选择性和生理功能提供更多依据。
