Runx2 调控 Nesprin1 表达对骨骼层状病样病理发展的关键作用：揭示成骨分化新机制

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Downregulation of Nesprin1 by Runx2 deficiency is critical for the development of skeletal laminopathy-like pathology

本文聚焦 Runx2 基因功能缺陷引发的疾病机制研究。Runx2 是骨形成的关键调控因子（Master regulator），其功能异常会导致锁骨颅骨发育不全（CCD）。研究发现 Runx2 缺陷会下调 Nesprin1 表达，引发核形态异常等病理变化，补充 Nesprin1 可改善相关症状，为理解 CCD 发病机制及治疗提供新思路。

　　

研究背景

核纤层是核膜的重要组成部分，其主要成分 Lamin A/C 参与多种细胞功能，且与多种遗传性疾病（层状病）相关。一些严重的层状病涉及骨病变，而骨骼病变也是锁骨颅骨发育不全（CCD）的特征。CCD 由 RUNX2 基因突变引起，Runx2 是成骨过程中的关键转录因子，但目前对其在成骨分化中的某些作用仍不明确。本研究旨在探究 RUNX2 对核膜结构、核机械刚性及染色体分离的调控作用，以及其在成骨细胞分化和功能中的影响机制。

研究结果

1. RUNX2 缺陷的 iPS 细胞在成骨分化培养基（OBM）中培养时出现异常细胞核：从 CCD 患者成纤维细胞获得的 RUNX2 缺陷（RUNX2^±）杂合 iPS 细胞、RUNX2 基因敲除（KO：RUNX2^?/?）iPS 细胞及回复（Rev：RUNX2^+/+）iPS 细胞，在 OBM 中培养后，RUNX2^+/?细胞的细胞核出现多条条纹且轻微扭曲，RUNX2^?/?细胞的细胞核则呈现出严重变形，类似分叶核中性粒细胞。这种核形态异常随时间增加，且在另一个 CCD 病例来源的 RUNX2^+/? iPS 细胞中也得到验证。同时，RUNX2 缺陷的 iPS 细胞在 OBM 中培养时，晚期成骨细胞分化和钙化相关基因表达降低，细胞增殖能力下降，但细胞凋亡不受影响。
2. 小鼠 iPS 细胞在 OBM 培养中的核表型：从 Runx2 缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）获得的小鼠 Runx2（^+/+、^±和^?/?）iPS 细胞，在成骨分化诱导过程中，Runx2^±和 Runx2^?/?细胞出现核变形，但程度和频率低于人类 iPS 细胞。
3. 核膜蛋白变化：通过定量实时 PCR 检测发现，RUNX2 缺陷（RUNX2^±和 RUNX2^?/?）的人 iPS 细胞经 OBM 处理后，Nesprin1（SYNE1）和 Lamin A/C（LMNA）的表达显著降低；在小鼠 iPS 细胞中，只有 Runx2^?/?细胞的 Lamin A/C 和 Nesprin1 表达明显下降，而 Nesprin2（SYNE2）在小鼠细胞中表达显著增加，可能补偿了 Nesprin1 的缺陷，使得小鼠细胞的核异常较轻。免疫荧光分析显示，在分化的人 RUNX2^+/?和 RUNX2^?/?细胞中，Nesprin1 蛋白表达减少，Lamin A/C 在 RUNX2^+/+细胞的质膜上定位相对均匀，而在 RUNX2^+/?和 RUNX2^?/?细胞中则呈异质性分布，部分定位于细胞质。通过建立慢病毒介导的系统表达 Nesprin1 和 Lamin A/C 发现，外源性表达 Nesprin1 能将 RUNX2^?/?细胞的异常核比例降至 RUNX2^+/+细胞水平，而 Lamin A/C 则不能。
4. 原子力显微镜（AFM）评估细胞特性：AFM 成像显示，RUNX2^+/+ iPS 细胞表面光滑均匀，有密集的肌动蛋白应力纤维微结构，弹性模量较高；而 RUNX2^±和 RUNX2^?/?细胞的细胞骨架结构受到明显影响，细胞周边较平，细胞核处呈圆形隆起，表现出机械异质性。对分离的细胞核进行 AFM 压痕分析发现，RUNX2^±和 RUNX2^?/?细胞的细胞核显著变软，细胞表面弹性模量降低，表明细胞更脆弱，细胞内张力明显减少。强制表达 Lamin A/C 可使细胞核刚度恢复正常，强制表达 Nesprin1 能轻微恢复细胞核刚度，且能显著恢复细胞内张力，而 Lamin A/C 则不能。
5. 肌动蛋白定位：通过鬼笔环肽标记 F-actin 并结合 Lamin B1 免疫染色发现，RUNX2^+/+细胞的细胞质和细胞核上有丰富的应力纤维，而 RUNX2^±和 RUNX2^?/?细胞的应力纤维数量明显减少，核周围几乎没有肌动蛋白纤维，肌动蛋白帽缺失，细胞膜下出现密集的肌动蛋白纤维束。外源性表达 Nesprin1 能恢复 RUNX2^?/?细胞的核结构和应力纤维分布，表明 Nesprin1 可促进应力纤维形成，维持正常的细胞内张力和核形态。
6. Emerin 磷酸化：Nesprin1 与细胞应激反应中 Emerin 的酪氨酸磷酸化有关。在硬基质上，RUNX2^+/+细胞的 Emerin 酪氨酸磷酸化明显，而 RUNX2^?/?细胞则很弱。强制表达 Nesprin1 能有效恢复 RUNX2^?/?细胞在硬基质上的 Emerin 酪氨酸磷酸化，而 Lamin A/C 的作用则较弱。
7. Lamin A/C 的切割靶点及释放核酸酶（CUT&RUN）分析：CUT&RUN 分析表明，在 RUNX2^+/+细胞中，Lamin A/C 在转录起始位点（TSS）附近有明显富集，而 RUNX2^?/?细胞则无此现象，说明 RUNX2 缺陷会破坏 Lamin A/C 的基因调控功能。Nesprin1 过表达可使 RUNX2^?/?细胞中 Lamin A/C 在 TSS 区域的富集恢复正常。
8. 核糖体 RNA（rRNA）合成：Runx2 可抑制 rRNA 合成，调节细胞从增殖到分化的资源分配。研究发现，RUNX2^?/?细胞的前体 rRNA 表达显著降低。
9. 单细胞 RNA 测序（RNA-seq）分析：对人 RUNX2^+/+、RUNX2^?/?及 RUNX2^?/?细胞在表达 Nesprin1 前后经 OBM 处理后的单细胞 RNA-seq 分析发现，所有细胞经 OBM 刺激 14 天后，可鉴定出 9 种主要细胞类型。其中，Cluster 7 表达 RUNX2 和 COL1A1 等，具有早期成骨细胞表型，可视为成骨祖细胞。RUNX2^?/?细胞中也存在 Cluster 7 细胞，但频率低于 RUNX2^+/+细胞。Nesprin1 表达可使 RUNX2^?/?细胞中 Cluster 7 细胞的频率与 RUNX2^+/+细胞相似，表明 Nesprin1 对成骨细胞分化有效。
10. 矿化能力评估：将人 RUNX2^?/?细胞在 OBM 中培养 28 天评估其矿化能力，结果显示 RUNX2^+/+ iPS 细胞可诱导矿化，而 RUNX2^?/?及表达 Nesprin1 的 RUNX2^?/?细胞均不能诱导矿化，说明表达 Nesprin1 的 RUNX2^?/?细胞未表达矿化所需的其他 RUNX2 靶基因。

讨论

本研究揭示了 RUNX2 在成骨过程中对核膜组装的重要作用机制。在人 iPS 细胞成骨分化早期，RUNX2/COL1A1 阳性成骨细胞可通过 GREM1 阳性细胞分化，与 RUNX2 是否存在无关。RUNX2 可直接诱导核膜主要蛋白 Lamin A/C 和 LINC 复合物成员 Nesprin1 的表达。Nesprin1 可诱导形成丰富的肌动蛋白应力纤维和核肌动蛋白帽，产生细胞内张力，与 LINC 复合物其他蛋白一起连接应力纤维，拉起核膜，维持正常核形态。RUNX2 有助于核膜形成，使 Lamin A/C 结合染色体调节基因表达，而 RUNX2 缺陷细胞的核形态异常，缺乏 Lamin A/C 的基因调控。

当骨骼干细胞分化为 RUNX2 阳性成骨细胞时，细胞所处环境从相对柔软变为坚硬，需不断应对机械压力，RUNX2 赋予细胞适应这种环境变化的能力。RUNX2 缺陷会导致 Nesprin1 表达降低，核周出现无肌动蛋白区域，核形态异常；而强制表达 Nesprin1 可恢复正常核形态和肌动蛋白纤维分布，表明 RUNX2^?/?细胞中肌动蛋白 - LINC 复合物系统受损，机械应激反应机制可能严重受损。

Nesprin1 表达可恢复肌动蛋白纤维及其张力，肌动蛋白纤维张力作用于 Nesprin1 使 Emerin 磷酸化，进而恢复核膜形态，说明细胞内张力拉起核膜是维持正常核形态的重要机制。Lamin A/C 基因缺陷的小鼠骨密度降低，易骨折，Lamin A/C 抑制会影响破骨细胞生成相关因子水平，增强破骨细胞生成能力。RUNX2 缺陷导致的异常核形态可能影响 Lamin A/C 的基因调控机制，改变成骨细胞分化相关基因表达，进而影响成骨细胞分化。而强制表达 Nesprin1 可恢复核形态和 Lamin A/C 在 TSS 区域的富集，说明核膜异常和基因失调在 RUNX2^?/?细胞和层状病中可能是相似的事件，即使存在 RUNX2，核纤层异常也可能导致骨分化异常。

人和小鼠 Runx2 基因缺陷的表型不完全一致，小鼠核异常较人轻，且小鼠 Runx2^±细胞 Nesprin1 表达降低不明显，Nesprin2 表达代偿性增加，这可能解释了小鼠 Runx2^±和 Runx2^?/?细胞核异常较少的原因，也表明小鼠 CCD 病理不能完全模拟人类。

虽然 RUNX2 是成骨细胞分化的关键分子，但早期成骨细胞命运决定和分化过程中 RUNX2 表达的时间点仍不明确。单细胞 RNA-seq 分析发现，RUNX2^?/?细胞也存在 RUNX2 转录，且 COL1A1+RUNX2 阳性的成骨细胞群体（Cluster 6 和 7）在 RUNX2 不存在时也会出现，说明 RUNX2 并非该细胞群体出现所必需。但 RUNX2 诱导的 Nesprin1 表达及正常核形态对 Cluster 7 细胞的正常增殖很重要，在 RUNX2 阳性细胞数量增加的过程中，RUNX2 可能通过诱导 Nesprin1 表达维持核内表观遗传环境。

综上所述，RUNX2 诱导的 LINC 蛋白 Nesprin1 建立了成骨细胞分化所需的核环境和核膜结构，正常的核膜结构由肌动蛋白细胞骨架产生的细胞内张力维持，从而使 Lamin A/C 正常结合染色质 TSS 区域，调节基因表达，促进染色质定位，有利于细胞分化。而 RUNX2 缺陷会破坏这些机制，严重影响核形态、核膜结构、机械刺激反应及成骨细胞分化。本研究对 RUNX2 在核膜组装中的功能发现，为理解 CCD 发病机制、核膜蛋白基因调控及层状病机制提供了重要线索。