ACBD3 蛋白：协调内质网 - 高尔基体联系助力蜱传脑炎病毒感染的关键宿主因子

《Journal of Virology》：The ACBD3 protein coordinates ER-Golgi contacts to enable productive TBEV infection

这篇研究聚焦黄病毒感染，发现宿主蛋白 ACBD3 与病毒蛋白 NS4B 协作，定位到内质网 - 高尔基体接触位点，促进内质网转化，对蜱传脑炎病毒（TBEV）的 RNA 复制和病毒粒子释放至关重要，为理解黄病毒感染机制提供了新视角。

　　### 黄病毒感染与内质网重塑的研究背景
黄病毒（Flavivirus）属于正单链 RNA 病毒，其感染过程涉及内质网（ER）的广泛重塑，这对病毒 RNA 基因组复制、新病毒粒子组装和释放至关重要。在感染过程中，病毒粒子经内吞作用进入宿主细胞，病毒包膜与内体膜融合后释放基因组，在 ER 上翻译为多聚蛋白，经加工形成结构和非结构蛋白。这些蛋白促使病毒劫持细胞，利用 ER 和分泌途径进行自身复制和组装。感染会产生广泛转化的 ER 膜（TERM），包含小的 ER 膜内陷和复制细胞器（ROs），用于合成新的基因组拷贝。新合成的 RNA 基因组可翻译产生更多病毒蛋白或包装成病毒粒子，最终分泌出细胞。然而，目前对病毒蛋白和宿主因子如何协同促进 ER 重塑以及这对病毒生命周期各步骤的影响知之甚少。

筛选 NS4B 近端宿主因子，发现多个 ERES 蛋白

研究人员利用基于抗坏血酸过氧化物酶（APEX2）的生物素化方法筛选与 TBEV 的 NS4B 蛋白定位接近的宿主蛋白。首先构建了可诱导表达 NS4B - APEX2 的 Flp - In T - REx HEK293T 细胞系，在诱导表达 NS4B - APEX2 后，添加生物素酚（BP）和过氧化氢（H₂O₂）对其附近蛋白进行生物素化，再通过中性亲和素珠纯化生物素化蛋白，并利用定量液相色谱 - 质谱（LC - MS）分析鉴定。以 P 值 <0.05 和丰度变化倍数（FC）>1.5 为标准筛选出 “命中” 蛋白，在未感染细胞和感染细胞中分别发现 381 个和 190 个命中蛋白，其中 173 个在两个实验中均被鉴定到。高得分的命中蛋白包括 ER 出口位点（ERES）蛋白 ACBD3、TFG、SEC23IP 和 KTN1 等，此外还有 17 个参与 ER - 高尔基体转运的蛋白。为测试这些蛋白对朗格特病毒（LGTV）感染的重要性，研究人员使用 GFP 报告辅助的 CRISPR - Cas9 基因靶向技术降低这些蛋白的表达，结果发现敲低 ACBD3、SMARCA1、KTN1 和已知宿主因子 GBF1 显著减少了感染细胞的比例，而 TFG 和 SEC23IP 敲低的影响不显著。

ACBD3 定位于 TERM 与高尔基体的接触位点

由于 ACBD3 表达降低对 LGTV 感染影响最大，研究人员聚焦该蛋白。通过共聚焦显微镜观察发现，ACBD3 以点状形式与 NS4B 信号在 ER 中共定位，利用邻近连接测定（PLA）进一步证实了 NS4B 与 ACBD3 位置接近。ACBD3 还部分与顺式高尔基体标记物 GM130 共定位，且在感染 LGTV 的细胞中，ACBD3、GM130 和 SEC23IP 存在类似的定位重叠，表明 ERES - 高尔基体接触位点在 ER 重塑后可能仍保持完整。结构光照明显微镜（SIM）观察显示，在感染和未感染细胞中，SEC23IP 信号与 GFP - ACBD3 阳性膜小管紧密相邻，感染细胞中 E 蛋白也存在于这些位点，且这些蛋白形成了复杂的交织网络。这些数据表明，感染期间 NS4B 可能与 ACBD3 协同作用，协调细胞膜的重塑。

ACBD3 缺失导致病毒复制、粒子释放减少和 TERM 形态改变

研究人员利用 ACBD3 基因敲除（KO）的 HEK293T 细胞研究 ACBD3 缺失对病毒感染过程的影响。焦点形成试验表明，ACBD3 KO 细胞中感染性 LGTV 粒子的产生减少；免疫印迹分析显示，感染的 ACBD3 KO 细胞中 LGTV 的 NS3、E 和 prM 蛋白表达降低；定量逆转录 PCR（RT - qPCR）结果表明，ACBD3 KO 细胞在感染后 8、12 和 16 小时产生的 LGTV RNA 显著少于野生型（WT）细胞。对其他黄病毒的研究发现，ACBD3 KO 对 TBEV 的影响比 LGTV 更大，对西尼罗河病毒（WNV）影响较小，对日本脑炎病毒（JEV）无影响。荧光显微镜观察发现，ACBD3 KO 细胞感染 LGTV 和 TBEV 后，感染细胞数量减少，但感染的 ACBD3 KO 细胞中 E 和 NS3 蛋白聚焦形成明亮的焦点，且这些区域的荧光强度显著高于 WT 细胞。电子显微镜（EM）分析显示，ACBD3 KO 细胞感染 TBEV 后，ER 转变为紧密堆积的膜卷曲结构，含有 ROs 和病毒粒子，但扩张的膜隔室较少，这表明 ACBD3 参与了 TERM 形成的协调过程。

ACBD3 KO 细胞中 RNA 复制和病毒样颗粒分泌均受损

为探究 ACBD3 对病毒 RNA 复制和病毒粒子产生的具体作用，研究人员分别进行了相关实验。利用 TBEV 复制子系统发现，虽然 ACBD3 KO 细胞中 NS 蛋白表达未受影响，但 dsRNA 几乎检测不到，表明缺乏 ACBD3 会阻碍 dsRNA 的有效复制。为研究 ACBD3 对病毒粒子出口的影响，使用病毒样颗粒（VLP）分泌试验，结果显示 ACBD3 KO 细胞中分泌的 VLP 分数显著低于 WT 细胞，这表明 ACBD3 对病毒粒子或病毒蛋白的运输很重要，可能通过协调它们在 TERM 中的运输来发挥作用。

ACBD3 通过 PI4KB 非依赖机制促进 LGTV 和 TBEV 感染

已知 ACBD3 在肠道病毒感染中通过招募 PI4KB 促进感染，研究人员探究该机制是否适用于黄病毒感染。使用 PI4KB 抑制剂 T - 00127 - HEV1 处理细胞，发现该抑制剂对 A549 细胞活力无影响，且在 1.25μM 浓度下可抑制脊髓灰质炎病毒（PV）感染，但对 LGTV 和 TBEV 复制无抑制作用，表明 PI4KB 招募不是 ACBD3 促进黄病毒感染的机制。

全长 ACBD3 是促进黄病毒感染所必需的

ACBD3 是一种多结构域蛋白，包含 ACB 结构域、Q 结构域和高尔基体动力学结构域（GOLD）。研究人员转染 ACBD3 KO 细胞表达 GFP 标记的野生型或突变型 ACBD3，然后感染 TBEV，结果显示转染野生型 ACBD3 可挽救感染，而单独转染 GOLD 结构域或缺乏 GOLD 结构域的 ACB - Q 构建体则不能。荧光显微镜分析表明，GFP - ACBD3 和 GFP - GOLD 与顺式高尔基体标记物 GM130 共定位，而 GFP - ACB - Q 主要定位于细胞质，表明 GOLD 结构域介导膜靶向。感染期间，GFP - GOLD 在整个 NS3 阳性的 TERM 中均有检测到，与 NS3 的重叠面积显著大于全长 ACBD3，且 NS4B - mCherry 的表达可改变 GFP - GOLD 的定位使其与 NS4B - mCherry 共定位。这些数据表明，GOLD 结构域可能负责感染期间 NS4B 和 ACBD3 的接近，但全长蛋白才是促进感染所必需的。

研究总结与展望

本研究发现 ACBD3 是蜱传黄病毒的促病毒宿主因子，它与 NS4B 结合，促进 TERM 的生成，有利于 RNA 复制和病毒粒子的出口。虽然黄病毒感染时宿主膜的广泛重排对感染至关重要，但具体过程仍有待深入研究。本研究为阐明 ERES - 高尔基体接触位点在黄病毒感染中的作用提供了起点，未来可进一步研究 ACBD3 在病毒粒子运输中的具体机制，以及它与其他宿主因子和病毒蛋白的相互作用，这将有助于深入理解黄病毒感染机制，为开发针对黄病毒感染的治疗策略提供理论依据。