沙门氏菌逃避抗体凝集机制新发现：1 型菌毛的关键作用

本文通过全基因组 CRISPR 干扰（CRISPRi）筛选，发现鼠伤寒沙门氏菌（STm）中 1 型菌毛（T1F）相关基因 fimW 可影响其对 Sal4 IgA 介导的凝集反应。T1F 或能助力 STm 在肠道环境中应对抗体，该研究为理解 IgA 抗体作用及开发黏膜疗法提供依据。

　　

研究背景

肠道上皮是众多肠道病原体的入侵门户，鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，STm）是其中备受关注的一种。它能引发自限性肠胃炎，近年来耐药和宿主适应性菌株增多，可导致侵袭性非伤寒沙门氏菌感染。

STm 入侵肠道组织过程复杂，涉及鞭毛运动和多种黏附素，入侵后还会扩散感染多种器官。二聚体和聚合体免疫球蛋白 A（IgA）抗体在肠道分泌液中可拦截 STm，通过凝集和免疫排斥阻止其附着于上皮细胞。IgA 介导的凝集在低细胞密度时通过 “连锁生长” 阻止子细胞分离，高细胞密度时则通过 “经典” 凝集形成宏观多细胞细菌垫，类似生物膜。

研究使用鼠单克隆 IgA 抗体 Sal4 来探究其在肠道免疫中的作用。Sal4 可捕获 STm，减少其对肠道相关淋巴组织的侵袭，还会影响 STm 的毒力，如抑制鞭毛运动、降低 T3SS - 1 活性等。Sal4 识别并结合 STm 表面脂多糖分子上的 O 抗原（O - Ag），其表位依赖于 oafA 基因编码的乙酰转移酶介导的修饰。

此前研究开发了 “雪球试验” 来可视化和量化 Sal4 IgA 介导的 STm 凝集，该试验发现凝集受细菌运动和细胞碰撞影响，且会出现气液界面的菌膜形成，表明运动和早期生物膜形成过程与 STm 的浮游 - 固着转变有关。本研究旨在通过 CRISPRi 筛选，进一步阐明 Sal4 介导 STm 凝集的潜在机制。

研究方法

1. 细菌菌株和生长条件：使用多种 STm 菌株及相关质粒，在 LB 培养基中常规培养，根据实验需求添加抗生素、阿拉伯糖等，控制培养温度和转速。
2. 生成 STm 突变体：利用 Lambda Red 重组技术，将目标基因替换为抗生素抗性盒，构建多种突变体菌株，如 ΔoafA、ΔfimW 等，并通过菌落 PCR 验证。
3. 构建 pFimW 和 pFimZ 质粒：PCR 扩增 fimW 和 fimZ 编码序列，克隆到 pBAD24 载体，转化到大肠杆菌和 STm 中，测序验证。
4. 单克隆抗体和杂交瘤：维持分泌 Sal4 IgA 的 B 细胞杂交瘤细胞系，使用重组 Sal4 IgA2m1 和嵌合 Sal4 IgG1 进行实验。
5. 雪球试验（snow globe assay）：将 STm 培养至对数中期，洗涤调整浓度后，在硼硅酸盐玻璃管中用 Sal4 IgA 处理，记录凝集情况，取上清测定菌落形成单位（CFU）。
6. 改良雪球试验用于富集 O5^- STm：将 oafA 突变体与 WT 菌株按比例混合，用 Sal4 IgA 处理，多次传代并测定 CFU，监测突变体富集情况。
7. CRISPRi 宏观凝集筛选：使用预先设计的 CRISPRi 文库菌株，与指示菌株混合，用 Sal4 IgA 处理，多次传代后提取质粒，进行 PCR 扩增、测序和数据分析，筛选影响凝集的基因。
8. 定量甘露糖敏感酵母凝集试验：培养 STm 菌株，与酵母和甘露糖按比例混合，通过分光光度计测量吸光度变化（ΔOD₆₀₀），定量检测 T1F 介导的凝集。
9. O5 - 抗原 ELISA 和斑点印迹：通过 ELISA 和斑点印迹检测 Sal4 与 STm 菌株的结合情况，评估 O5 抗原表达和可及性。
10. 软琼脂运动试验：在含或不含 Sal4 IgA 的软琼脂平板上接种 STm 过夜培养物，培养后测量细菌迁移直径，评估运动能力。
11. HeLa 细胞维持和侵袭试验：培养 HeLa 细胞，将不同 STm 菌株与 HeLa 细胞共培养，用 Sal4 IgA 处理，通过计算竞争指数评估菌株侵袭能力。
12. 结晶紫试验：将 STm 菌株培养至对数中期，与 Sal4 IgG 或 IgA 处理，结晶紫染色，测量吸光度（Abs₅₇₀），评估生物膜形成能力。
13. 统计分析和绘图：使用 GraphPad Prism 10.2.3、Python 3.7、R 4.2.1 等软件进行数据分析和绘图。

研究结果

1. STm 全基因组 CRISPRi 筛选鉴定 Sal4 IgA “逃逸” 突变体：利用 CRISPRi 文库和雪球试验，对经 Sal4 IgA 处理的 STm 菌株进行筛选。结果显示，多次处理后，373 个间隔序列在培养上清顶部富集，映射到 307 个基因和 47 个启动子区域，包括参与环二鸟苷酸代谢、外膜组成等相关基因。其中，fimW 基因被多个间隔序列靶向，其编码 1 型菌毛（T1F）的负调节因子。同时，筛选出 119 个在未处理条件下频率高的间隔序列，多与鞭毛生物合成和组装基因相关，表明鞭毛运动在 Sal4 IgA 介导的凝集中有复杂作用。
2. STm fimW 缺失突变体在雪球试验中逃避 Sal4 介导的凝集：构建 14 个候选基因的缺失突变体和 flhC 突变体，用雪球试验检测 Sal4 对其凝集能力的影响。结果发现，除 ΔoafA 和 ΔfimW 突变体外，多数突变体与 WT 菌株对 Sal4 介导的凝集敏感性相似。ΔfimW 突变体在混合培养中也能逃避凝集，且其 O5 抗原表达和可及性不受影响。
3. STm fimW 突变体的表型特征和互补实验：通过定量甘露糖敏感酵母凝集试验证实 ΔfimW 突变体具有超菌毛化表型，其凝集酵母能力显著高于 WT 菌株，且该表型可被质粒编码的 fimW 互补恢复。
4. T1F 在逃避 Sal4 IgA 中的直接作用：构建 fimA 突变体，发现其对 Sal4 IgA 介导的凝集敏感，且在甘露糖敏感酵母凝集试验中存在缺陷，表明 fimW 突变体逃避凝集是由于 T1F 表达增加。此外，培养条件促进 WT STm 的 T1F 表达时，也能逃避 Sal4 介导的凝集，进一步证明 T1F 的作用。
5. STm fimW 突变体对 Sal4 IgA 其他诱导效应的敏感性：在软琼脂运动试验中，ΔfimW 突变体与 WT 菌株在 Sal4 IgA 处理下运动能力无差异，表明超菌毛化表型不能使其逃避 Sal4 介导的运动抑制。在 HeLa 细胞侵袭试验中，ΔfimW 突变体在无 Sal4 IgA 时侵袭能力较强，但在有 Sal4 IgA 时与 WT 菌株同样敏感，说明该突变体虽能逃避凝集，但对 Sal4 IgA 的其他效应仍敏感。
6. STm fimW 突变体在 Sal4 处理后在气液界面形成坚固生物膜：利用结晶紫染色评估生物膜形成能力，发现 Sal4 IgA 处理后，ΔfimW 突变体在聚苯乙烯和玻璃表面的生物膜形成显著增加，而 WT、ΔoafA 和 ΔflhC 菌株无明显变化。Sal4 IgG 处理后，ΔfimW 突变体在气液界面形成的生物膜比 WT 菌株更厚、染色更强，这解释了其在雪球试验中的逃避表型。

研究讨论

分泌型 IgA 在保护肠道上皮免受细菌病原体侵害中起关键作用，其介导的经典凝集可使细菌从浮游感染状态转变为聚集非感染状态。本研究通过 CRISPRi 筛选发现 fimW 基因，其编码的 T1F 负调节因子影响 Sal4 IgA 介导的凝集。ΔfimW 突变体超菌毛化，能逃避凝集但对 Sal4 IgA 的其他效应仍敏感，且易在气液界面形成生物膜。

研究提出 Sal4 IgA 诱导 STm 从浮游到固着转变的模型：Sal4 IgA 识别 O5 抗原后，触发一系列反应。鞭毛运动促进细菌与表面接触和信号转导，WT STm 形成更多细胞 - 细胞碰撞产生的聚集物，而 ΔfimW 突变体高表达的 T1F 促进其与非生物材料和气液界面的附着。

CRISPRi 筛选条件有利于富集靶向 fimW 的间隔序列，T1F 是实验室条件下非生物表面附着的主要介导者。鞭毛运动在 Sal4 介导的凝集中有多面性，影响生物膜形成和细菌在凝集过程中的行为。此外，研究还发现一些与环二鸟苷酸代谢相关的酶在筛选中富集，虽后续实验未证实其在凝集反应中的作用，但仍暗示环二鸟苷酸可能参与 Sal4 应激反应。

本研究表明 T1F 不仅是毒力因子，还能促进 STm 在外部环境中的生存。Sal4 作为中和剂，在其靶表位存在时有效，但其诱导生物膜形成对细菌清除和传播的影响还需进一步研究。未来需深入探究 Sal4 IgA 诱导 STm 生物膜形成的机制，以更好理解 SIgA 在黏膜表面的保护作用。