高致病性禽流感H5N1牛源分离株的CL-2实验室安全灭活策略研究

本文系统评估了高致病性禽流感(HPAI)H5N1牛源病毒在CL-3实验室样本的安全灭活方案，创新性地验证了Buffer AVL/95%乙醇和Buffer RLT/70%乙醇对细胞上清液、组织及体液样本的完全灭活效果，同时证实0.5% Triton X-100联合60℃热处理可保持血清和乳清抗体活性。研究为H5N1样本从CL-3向CL-2实验室的安全转移提供了标准化操作流程，显著提升了病原体研究的可及性和安全性。

　　

ABSTRACT
高致病性禽流感(HPAI)H5N1病毒在2024年3月首次于德克萨斯州奶牛群中检出后迅速蔓延至全美500余个牧场。该研究针对新出现的牛源H5N1分离株A/dairy cattle/Texas/24-008749-002/2024，系统评估了三种灭活方案在不同生物样本中的效果。

INTRODUCTION
源自1996年中国鹅/广东谱系的HPAI H5N1病毒已进化出8个分支，其中2.3.4.4b分支通过野生鸟类迁徙于2021/2022年传入北美。2024年该病毒突破种间屏障感染反刍动物，在奶牛中引发典型流感症状并可通过乳汁高效传播。鉴于HPAI被列为风险组3病原体，常规研究需在生物安全等级3(CL-3)实验室进行，但严苛的操作限制严重制约研究效率。

MATERIALS AND METHODS
采用犬肾细胞(MDCK)培养病毒，制备含10⁶ TCID₅₀/mL的细胞上清液、组织匀浆及体液(乳汁/血液/尿液)样本。RNA提取组分别测试Qiagen公司的Buffer AVL(含95%乙醇)和Buffer RLT(含70%乙醇)灭活效果；抗体检测组采用0.5% Triton X-100联合60℃30分钟热处理方案。通过4轮MDCK细胞传代观察细胞病变效应(CPE)，并采用M基因特异性引物探针进行RT-qPCR验证。

RESULTS
病毒灭活验证显示：

1. Buffer RLT+70%乙醇组：感染细胞、组织匀浆及加标体液经处理后，所有样本传代均未出现CPE，RT-qPCR Ct值始终>30；
2. Buffer AVL+95%乙醇组：细胞上清液及加标体液完全灭活，病毒RNA未出现扩增；
3. 热处理组：血清和乳清样本经Triton X-100处理后，中和抗体效价保持稳定(40-80)，56℃与60℃处理组仅出现1个稀释度差异。

DISCUSSION
研究揭示：

• 胍盐缓冲液通过破坏病毒包膜和核衣壳实现完全灭活，其中Buffer RLT更适合含细胞样本，Buffer AVL对无细胞体液效果更佳；
• 乳清中病毒载量异常降低可能与乳脂球膜(MFGM)的病毒吸附作用有关；
• 60℃热处理在保证灭活效率的同时，最大程度保留了抗体结合活性。

该研究建立的标准化流程成功解决了HPAI H5N1样本跨生物安全等级转运的技术瓶颈，为后续宿主免疫应答研究和分子流行病学调查提供了关键技术支撑。特别值得注意的是，针对乳汁样本的特殊处理方案为奶牛群体监测提供了安全高效的检测路径。