利用拉曼和自发荧光光谱同时检测光养和叶际细菌的单细胞色素分析：探索微生物色素世界的新钥匙

本文通过同时检测紫色光养细菌单细胞的共振拉曼和自发荧光光谱，分析微生物色素多样性。该方法可用于评估紫色光养细菌等的色素表达，还能揭示叶际微生物细胞的色素多样性，为研究微生物与光的关系提供了有力工具。（Raman 和 autofluorescence spectra）

　　### 引言
微生物能产生多种色素，如类胡萝卜素、卟啉和胆绿素等，这些色素与光能捕获、光传感和抗逆性相关，在食品和人类健康领域有重要应用。了解环境微生物中色素的多样性，有助于理解微生物的生态生理学，还能筛选有用的微生物。

光养细菌含有细菌叶绿素（BChls）和类胡萝卜素，广泛分布于淡水、海洋和极端环境中。然而，由于基因分析难以区分光养细菌，且其光合色素的表达受多种环境因素调节，因此仅靠基因分析无法充分评估其在环境中的分布和生态生理学，需要结合色素表达评估。

荧光显微镜和拉曼光谱显微镜已被用于研究光合色素，但这两种方法的互补信息很少被同时利用，荧光通常被视为干扰拉曼信号的背景。在本研究中，研究人员展示了在单细胞水平上同时检测模式光养细菌中类胡萝卜素的共振拉曼光谱和自发荧光光谱的方法，该方法可用于检测多种光养细菌，并区分不同细菌细胞的色素组成。

研究人员还评估了植物叶表面的微生物，这些微生物与宿主植物的健康和生长密切相关。叶表面环境对微生物来说具有挑战性，但仍有一定数量的微生物定植。此前已有研究报道了叶际光养细菌的多样性，但不清楚基因分析中显示的具有不同光合基因的细菌谱系在植物表面是否具有光养活性。本研究通过检测叶际微生物细胞的自发荧光和类胡萝卜素色素，解决了这一问题。

材料和方法

1. 细菌菌株和培养条件：研究使用了 7 株紫色光养细菌（厌氧和好氧无氧光养细菌）、4 株非光养且产类胡萝卜素的细菌以及 1 株既不产生光合色素也不产生类胡萝卜素的细菌。光养细菌根据种类不同，分别在厌氧或好氧条件下，特定培养基中培养；非光养细菌则在液体培养基中好氧培养。通过测量 660nm 处的光密度监测细菌生长。
2. 采样和分离程序：从日本兵库县三田市户外生长的白三叶草（Trifolium repens）上采集叶片样本，将叶片在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4）中超声处理，过滤上清液后进行光谱测量。为分离微生物，将滤液接种到 PYS 平板上，多次转移和划线以获得纯培养物，共分离出 6 株微生物菌株。
3. 单细胞拉曼和自发荧光光谱分析：使用实验室构建的共聚焦拉曼光谱仪，以 632.8nm 的 He-Ne 激光作为激发光，测量单细胞的拉曼和自发荧光光谱。为避免玻璃背景干扰，利用光镊捕获单个微生物细胞进行测量。对于植物叶样本，先对滤液进行离心、浓缩和洗涤，然后测量石英盖玻片上的细胞样颗粒的光谱。
4. 拉曼 - 自发荧光光谱分析：使用标准卤素光源校准光谱灵敏度，通过减去 PBS 光谱或石英玻璃和 PBS 信号，去除背景干扰。通过计算时间序列中第一个光谱（0 - 30s）与最后一个光谱（60 - 90s）的差值，提取自发荧光光谱；从初始光谱（0 - 30s）中减去代表自发荧光成分的基线，提取类胡萝卜素的共振拉曼光谱。对共振拉曼光谱和自发荧光光谱进行一系列分析，包括确定峰位置、计算强度、主成分分析（PCA）和 X-means 聚类等。
5. 16S rRNA 基因序列分析：使用特定引物从新鲜菌落中扩增 16S rRNA 基因，进行 PCR 扩增和测序，通过 NCBI BLAST 比较序列同源性。

结果

1. 不同菌株的单细胞光谱观察：光养细菌在诱导光合色素合成的条件下培养时，第一个光谱（0 - 30s）中出现自发荧光和类胡萝卜素的共振拉曼峰，随后因光漂白信号大幅减弱。非光养且产类胡萝卜素的细菌显示出类胡萝卜素的特征峰，但无明显自发荧光光谱成分。在有氧条件下培养的R. sphaeroides，其色素光谱几乎检测不到。
2. 类胡萝卜素共振拉曼光谱的特征：不同光养细菌和产类胡萝卜素的非光养细菌中，类胡萝卜素的共振拉曼峰位置存在差异。光养细菌中，B. viridis的 ν₁峰位置最高，R. rubrum的最低。类胡萝卜素的 ν₁峰位置与共轭链长度相关，共轭链越长，ν₁峰位置越低。不同细菌物种的类胡萝卜素峰位置存在较大差异，部分物种内的细胞间也有较大变化，这可能与细胞内多种类胡萝卜素的组成异质性有关。
3. 光养细菌自发荧光光谱的特征：不同光养细菌的自发荧光光谱存在差异。含 BChl a的厌氧光养细菌在约 690nm 处有荧光峰，部分菌株在 740nm 至更长波长处荧光强度增加，有菌株在约 760nm 处有肩峰；含 BChl b的B. viridis则无这些特征。PCA 分析显示，光养细菌的自发荧光光谱大致按物种聚类，B. viridis与其他含 BChl a的菌株形成明显分离的簇。光养细菌的自发荧光强度高于非光养细菌，不同光养细菌之间也存在差异。
4. 叶际微生物细胞的拉曼和自发荧光光谱：从植物叶样本中检测到 85 个细胞样颗粒具有典型的类胡萝卜素共振拉曼峰，部分颗粒的光谱具有类似光养细菌的自发荧光基线。叶际细胞的自发荧光强度普遍较低，类胡萝卜素的 ν₁峰位置在 1500 - 1525cm^-1之间，可能含有多种类胡萝卜素。PCA 和 X-means 聚类将自发荧光光谱分为三个簇，部分簇的光谱形状与模式光养细菌相似。
5. 叶际分离菌株的系统发育和光谱特征：从叶际分离出 6 株微生物菌株，经 16S rRNA 基因分析，它们与Methylobacterium、Sphingomonas、Curtobacterium和Chryseobacterium属密切相关。其中，STP2 和 STP3 可能含有与Methylobacterium中 BChl a类似物相关的色素；STY1 和 STY2 的拉曼峰位置与含 β - 胡萝卜素的微生物相似；STY3 的拉曼峰位置与 flexirubin 相似。

讨论

1. 光养细菌自发荧光光谱的起源和性质：检测到的荧光峰并非来自 BChl a本身，可能是与 BChl a相关的色素，如光氧化产物。虽然自发荧光光谱的起源尚未完全阐明，但这些光谱模式有助于检测光养细菌，包括通常难以检测的含 BChl b的细菌，并识别 BChls 的类型。厌氧光养细菌的自发荧光强度存在种间差异，R. gelatinosus的较低，可能与其光合装置发育程度低有关；好氧光养细菌的自发荧光强度也较弱。光养细菌细胞间自发荧光强度的变化是否反映光合装置的表达，还需进一步研究。
2. 细菌物种和细胞间类胡萝卜素拉曼峰的变化：不同细菌物种的类胡萝卜素拉曼峰分布存在差异，部分物种间有重叠。通过提取类胡萝卜素的峰位置并比较光谱形状，可以研究细胞内类胡萝卜素结构的多样性。类胡萝卜素共振拉曼峰的强度不仅取决于其在细胞中的浓度，还与增强因子有关，因此不能简单用于区分物种或生理状态。
3. 叶际微生物研究结果的意义：叶际微生物数量庞大，评估其对光的利用对理解生物地球化学循环很重要。叶际细胞的自发荧光光谱形状与模式光养细菌相似，但强度较低。研究人员分离出的Methylobacterium菌株，其自发荧光光谱与叶际细胞的部分簇相似，但光养能量利用与该菌功能和定植能力的关系仍不清楚。该研究技术有助于更好地理解光养细菌的作用，结合单细胞分离技术和新兴培养技术，可为筛选有用微生物提供新方法。