《Nature Methods》Perturb-tracing 技术：解锁 3D 基因组调控因子筛选新密码

《Nature Methods》：Perturb-tracing enables high-content screening of multi-scale 3D genome regulators

为解决 3D 基因组染色质拓扑结构调控因子研究受限，缺乏高效筛选技术的问题，研究人员开展了名为 Perturb-tracing 的技术研究。他们发现众多新调控因子，研究成果发表在《Nature Methods》上明确其多尺度作用及与已知机制关联，还揭示染色质压实与核形态关系，为 3D 基因组研究提供新平台。

　　

** 在生命科学的微观世界里，基因组的奥秘一直吸引着众多科研人员不断探索。3D 基因组的组织方式在生物的发育、衰老以及疾病发生过程中都有着至关重要的作用，它就像一本隐藏着无数生命密码的 “天书”，控制着基因的表达与功能。然而，目前我们对染色质拓扑结构的调控因子了解还不完全，而且也缺乏能够高效筛选多尺度染色质组织新调控因子的技术。这就好比在黑暗中摸索，我们知道前方有宝藏，但却缺少寻找宝藏的有效工具。为了突破这一困境，来自耶鲁大学（Yale University）等机构的研究人员展开了一项极具意义的研究。他们的研究成果发表在《Nature Methods》上，为 3D 基因组的研究开辟了新的道路。

研究人员开发了一种基于图像的高通量高内涵筛选平台 ——Perturb-tracing。该平台主要运用了三个关键技术：一是汇集式 CRISPR 筛选（pooled CRISPR screens），能够对众多候选基因进行大规模筛选；二是细胞条形码读出方法（BARC-FISH），可以准确识别每个细胞中的基因扰动；三是染色质追踪（chromatin tracing），用于绘制单个细胞中众多基因组位点的 3D 空间组织表型效应。研究使用的样本主要是人类细胞系，包括 A549 人肺癌细胞系和 hTERT RPE-1 细胞系等。

在研究结果部分，首先是 Perturb-tracing 实现了基于图像的 3D 基因组调控因子筛选。研究人员利用 CRISPR-Cas9 技术构建了敲除细胞文库，通过 BARC-FISH 读取条形码 RNA 来识别基因扰动，并结合染色质追踪技术，对染色体 22（chr22）的 3D 空间组织进行分析。经过对大量细胞的研究，他们从筛选的 137 个基因中鉴定出 21 个新的 3D 基因组组织调控因子。这些调控因子在不同长度尺度上发挥作用，从染色质结构域、区室到染色体区域，影响着染色质的折叠构象。

接着，研究人员对多尺度染色质折叠的调控因子进行了深入探究。通过研究 chr22 上相邻 TAD 之间的空间距离、A - B 区室化的染色质接触频率以及染色体区域的整体紧凑度，发现不同基因的敲除会导致这些指标发生显著变化。例如，已知的黏连蛋白加载蛋白 NIPBL 的缺失会导致相邻 TAD 距离显著增加，而 CTCF 的缺失则会使相邻 TAD 距离显著减小。此外，还发现了一些新的候选调控因子，如肿瘤抑制因子 RB1、MRVI1 和 PIP5K1B 等，它们的缺失会增加相邻 TAD 距离；而 GLDC、NR4A1 和 ZNF114 等基因的缺失则会产生相反的表型。

然后，相关性分析将新调控因子与已知的 3D 基因组机制联系起来。通过量化新调控因子与 NIPBL 在控制短距离（<3Mb）染色质距离方面的相关性，发现 DDX24、MRVI1 和 ZNF114 与 NIPBL 存在显著相关性，表明它们可能与环挤出机制至少存在部分相互作用。同时，研究还发现部分新调控因子的调控效应与 A - B 区室化机制相关，通过对 18 个顶级命中基因的相关性分析和层次聚类，发现一些基因形成了具有相关 3D 基因组效应的簇，提示了潜在的共调控机制。

在对选定的顶级命中基因进行个体验证时，研究人员重点关注了 CHD7。CHD7 是一种染色质重塑剂，与 CHARGE 综合征相关。通过 CRISPR 敲除、RNA 干扰（siRNA）敲低和过表达实验，在不同细胞系和基因组背景下验证了 CHD7 对染色质组织的调控作用。结果表明，CHD7 促进长距离染色质压实和接触，其缺失会导致染色质解压缩，而过度表达则会使染色质压实。此外，还对 PCBP1 和 ZNF114 进行了验证，结果与初步筛选结果一致，进一步支持了 Perturb-tracing 筛选的有效性。

最后，研究人员还鉴定出了核形态调控因子。通过分析 DAPI 染色的变化，发现 RB1 或 MYBPH 的敲除会降低核 DAPI 染色的不均匀性，而 TRIM36 和 EEPD1 的敲除会降低核的球形度，导致多叶核形状。进一步研究发现，核球形度与染色质折叠特征之间存在显著相关性，染色质压实与更球形的核形状相关，这一结论通过实验和模拟得到了验证。

在研究结论和讨论部分，Perturb-tracing 技术的出现为 3D 基因组研究带来了新的希望。它能够系统地同时分析数百个候选基因对空间基因组组织多个方面的影响，帮助我们更深入地了解基因组的调控景观和基因组结构的功能。虽然该技术还存在一些局限性，如无法轻易区分 3D 基因组的直接和间接调控因子，可能存在假阴性等问题，但未来可以通过更复杂的 CRISPR 设计和降低命中调用的严格性来解决。总体而言，Perturb-tracing 技术为绘制染色质组织的 “调控组” 提供了有力的工具，有望推动 3D 基因组研究取得更多突破性的进展，让我们对生命的奥秘有更深入的认识。**