创新蛋白降解技术：开启农业应用新征程 —— 靶向害虫蛋白的 PROTACs 研究

《Communications Biology》：Pioneering protein degradation for agricultural applications

在农业面临农药抗性增加、环境法规趋严等问题时，研究人员开展了将蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）应用于农业的研究。他们发现昆虫 VHL E3 连接酶可用于 PROTACs，开发的 PROTACs 能有效降解害虫蛋白，为农业害虫防治提供新途径。

　　在农业生产的广阔战场上，害虫一直是威胁作物生长、影响粮食产量的 “顽固敌人”。传统的农药虽然在一定程度上能够抵御害虫侵袭，但随着时间的推移，问题逐渐凸显。一方面，害虫对农药的抗性不断增强，使得农药的效果大打折扣；另一方面，日益严格的环境法规对农药的使用提出了更高要求，而新的有效成分研发又进展缓慢。在这样的困境下，开发创新的作物保护解决方案迫在眉睫。
与此同时，靶向蛋白降解（TPD）技术在药物研发领域正掀起一场革命。其中，蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）凭借独特的作用机制脱颖而出。PROTACs 是一种异双功能小分子，它能招募天然存在的 E3 泛素连接酶（E3 ubiquitin ligase），让目标蛋白（POI）发生泛素化，随后通过泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）将其降解。与传统小分子抑制剂相比，PROTACs 具有诸多优势，比如可以彻底降解目标蛋白，而非仅仅抑制；能够作用于一些缺乏酶活性的蛋白；还能以催化方式发挥作用，在较低浓度下就有效，降低脱靶效应和整体毒性。然而，在医疗领域大放异彩的 PROTACs 技术，在农业领域却尚未得到探索。
为了填补这一空白，来自 Oerth Bio（美国）和 Bayer CropScience AG（德国）的研究人员踏上了探索之旅。他们致力于研究能否将 PROTACs 技术应用于农业害虫防治，通过精准降解害虫体内的关键蛋白，开辟一条全新的作物保护路径。经过一系列深入研究，他们取得了令人瞩目的成果，相关研究论文发表在《Communications Biology》上。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，通过同源建模（Homology Modeling）构建昆虫蛋白的三维结构模型，以了解蛋白特征；其次，利用表面等离子共振（SPR）技术评估蛋白与化合物的结合亲和力；再者，借助体外泛素化（IVQ）实验检测蛋白的泛素化情况；最后，运用质谱技术（如 Sf9 细胞降解实验和体内实验中的质谱分析）监测蛋白丰度变化 。
下面让我们详细看看研究结果：

1. 昆虫蛋白同源物的鉴定与表征：研究人员利用 BlastP 搜索，在草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）中鉴定出人类 VHL（hsVHL）、hsBRD4 和 hsWDR5 的同源物，分别为 sfVHL、sfBRD3 和 sfWDS。尽管 sfVHL 与 hsVHL 序列同一性仅 29%，但关键的配体结合位点大多保守。sfBRD3 与人类 BRD4 的第二个溴结构域有较高同源性，sfWDS 与人类 WDR5 的序列同一性高达 93%。
2. 人类配体与重组昆虫蛋白的结合：实验表明，基于人类 VHL、BRD4 和 WDR5 配体设计的化合物，能够与相应的昆虫同源蛋白紧密结合。如一些基于人类 VHL 配体的化合物，与 sfVBC 的结合亲和力在低至中纳摩尔范围；针对 sfBRD3 和 sfWDS 设计的配体，也展现出良好的结合效果，这为后续 PROTACs 的开发奠定了基础。
3. PROTACs 对 sfWDS 的降解作用：最初测试的基于人类 WDR5 - VHL 的 PROTACs，如 MS67 和 MS33，虽能与 sfWDS 和 sfVBC 紧密结合并诱导三元复合物形成，但在细胞实验中无法有效降解 sfWDS。经过对 PROTAC 连接子的优化，研究人员设计出化合物 17、18 和 19。其中，18 和 19 在 Sf9 细胞中能高效降解 sfWDS，降解率可达 64 - 67%，DC50?约为 50 nM，且具有较高的细胞内浓度和选择性，全球蛋白质组学分析显示其脱靶效应极小。
4. PROTACs 对 sfBRD3 的降解作用：研究人员基于多种 sfBRD3 配体开发了 PROTACs 21 - 24。这些 PROTACs 与 sfBRD3 (BD2) 和 sfVBC 具有较强的结合亲和力，且能诱导三元复合物形成。在 Sf9 细胞中，21 和 24 在 1 μM 浓度下处理 24 h 后，可使 sfBRD3 蛋白丰度降低超过 85%，23 和 22 也能达到 70% 和 74% 的降解水平，DC50?约为 5 nM。全球蛋白质组学分析表明其具有高度的靶向特异性。
5. PROTACs 在幼虫体内的降解效果：研究人员在草地贪夜蛾幼虫体内进行实验，发现一些 PROTACs 能显著降解目标蛋白。如化合物 21 可使 sfBRD3 降解 68%，但化合物 24 因结构问题未能有效降解。对于 sfWDS，PROTACs 18 和 19 分别能使其降解 35% 和 22%。同时，实验表明这些降解过程依赖于 sfVHL 的参与，且未观察到幼虫出现明显的毒性反应。
   研究结论和讨论部分指出，本研究成功利用 sfVHL 实现了对两种不同目标蛋白在细胞和幼虫体内的降解，使 sfVHL 成为首个可用于农业应用的 PROTAC - ready E3 连接酶，所开发的 PROTACs 也是首次在非哺乳动物细胞和生物体中证明可降解目标蛋白，这为 PROTAC 技术在农业领域的应用提供了有力的证据。
   研究还揭示了 PROTAC 连接子在优化降解效果中的关键作用，合适的连接子长度、刚性和构象空间，以及正确的三元复合物几何结构和出口向量，对提高降解效率至关重要。此外，虽然 PROTACs 的体外亲和力与体内降解之间的关系尚未完全明确，但三元复合物的稳定性和协同性似乎起着重要作用。
   尽管 PROTACs 在农业应用中展现出巨大潜力，但目前其物理化学性质仍需进一步优化，以开发出可行的杀虫产品。未来研究可针对具有更高杀虫潜力的靶点设计 PROTACs，探索昆虫特异性连接酶招募剂和合适的配方。同时，鉴于昆虫体内众多未被充分研究的 E3 连接酶，进一步挖掘和验证这些连接酶，有望推动一系列用于昆虫控制的 PROTAC - ready E3 连接酶的开发。
   总之，这项研究为农业害虫防治带来了新的希望，PROTAC 技术有望成为下一代农药开发的重要手段，为保障全球粮食安全做出贡献。