肠道微生物谷氨酸脱羧酶合成多功能神经调节分子：开启神经疾病治疗新希望

在神经疾病研究领域，肠道微生物群失调与多种神经疾病相关，但其产生神经调节分子的化学机制不明。研究人员针对脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）的谷氨酸脱羧酶（BfGAD）展开研究，发现其能生成多种神经调节分子，还通过进化 BfGAD 提高了牛磺酸产量。这为神经疾病治疗提供了新思路。

　　在神经科学与微生物学交叉的前沿领域，许多神经疾病如癫痫、精神分裂症、自闭症谱系障碍（ASD）、阿尔茨海默病等，都与抑制性神经递质 γ- 氨基丁酸（GABA）水平低下存在关联。同时，牛磺酸作为大脑中丰富的氨基酸，也在神经调节中发挥着重要作用，其浓度变化与阿尔茨海默病等疾病密切相关。然而，目前肠道微生物群失调与神经疾病之间的联系虽已被发现，但肠道微生物产生神经调节分子的化学机制却鲜为人知。

为了深入探索这一神秘的化学机制，来自亚利桑那州立大学（Arizona State University）的研究人员展开了一项具有开创性的研究。他们将研究重点聚焦于脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）中的一种酶 —— 谷氨酸脱羧酶（BfGAD）。经过一系列深入研究，研究人员发现 BfGAD 有着令人意想不到的功能，它能够形成多种神经调节分子，包括 γ- 氨基丁酸（GABA）、亚牛磺酸、牛磺酸、高牛磺酸和 β- 丙氨酸。不仅如此，研究人员通过对 BfGAD 进行进化改造，成功使牛磺酸的产量翻倍，并提高了其对底物 L - 谷氨酸的特异性。这一研究成果意义重大，为未来通过调节肠道微生物来治疗神经疾病提供了全新的思路和潜在的治疗策略，相关研究成果发表在《iScience》杂志上。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是生物信息学分析，用于探索 Bacteroides 属中 GAD 基因的分布和序列相似性；蛋白质纯化技术，借助 Ni-NTA 亲和层析纯化重组野生型 BfGAD 和工程变体；光谱研究技术，通过光谱分析研究 PLP 辅因子的 pH 依赖性变化；定点突变技术，构建 BfGAD 的工程变体；以及多种检测技术，如顶空气相色谱（GC）检测二氧化碳、薄层层析（TLC）和液相色谱 - 电喷雾电离 - 串联质谱（LC-ESI-MS/MS）鉴定反应产物。

研究结果主要包含以下几个方面：

• GADs 在 Bacteroides 属中普遍存在：生物信息学分析显示，Bacteroides 属的许多物种都含有注释为 GAD 的基因，且不同物种的 GAD 序列相似度较高。从模式生物 B. fragilis 中选取的 BfGAD，与其他肠道微生物的 GAD 在催化残基上高度保守。
• 野生型 BfGAD 形成寡聚体：纯化的重组野生型 BfGAD（BfGAD_WT）在 SDS-PAGE 分析中呈现单体形式（56 kDa），而在天然 PAGE 和凝胶过滤色谱分析中表明其在酸性和中性条件下以动态的二聚体和四聚体形式存在，且这种寡聚体形式会随 pH 值变化而改变。
• PLP 辅因子结合的 BfGAD_WT发生 pH 依赖性互变异构变化：光谱研究发现，BfGAD_WT与 PLP 辅因子结合后，存在 335 nm 和 420 nm 两个吸收峰，分别对应烯醇亚胺和酮烯胺两种互变异构体形式。其比例随 pH 值变化而改变，且与酶活性密切相关，在 pH 4.7 时催化效率最高。
• BfGAD_WT存在变构调节的证据：活性测定实验表明，BfGAD_WT的初始反应速度与酶浓度呈线性关系。而当改变 L - 谷氨酸浓度时，底物浓度与初始速度的关系呈现 S 形曲线，这表明 BfGAD_WT存在协同性，属于同促变构调节。
• 工程化 BfGAD 变体表现出结构和催化扰动：基于与 EcGAD 和 BtGAD 的结构比对，研究人员设计并构建了 BfGAD_WT的两个变体 D104N 和 F81W。这两个变体改变了底物类似物与活性位点残基之间的氢键相互作用，导致催化活性发生变化，D104N 的初始速度提高了 1.7 倍，F81W 则降低了 2.5 倍。
• 野生型和工程化 BfGADs 可以脱羧除 L - 谷氨酸以外的底物：研究发现，野生型和工程化 BfGADs 虽然不能脱羧 D - 谷氨酸，但能够利用 L - 半胱氨酸磺酸（L-CSA）、L - 半胱氨酸酸（L-CA）、L - 高半胱氨酸酸（L-HCA）和 L - 天冬氨酸（L-Asp）等多种底物进行脱羧反应，并通过顶空气相色谱检测到了反应产生的二氧化碳。
• 野生型和进化的 BfGADs 产生多种神经调节分子：通过薄层层析和液相色谱 - 电喷雾电离 - 串联质谱分析，证实了野生型和工程化 BfGADs 能够从不同底物中产生多种神经调节分子，如亚牛磺酸、牛磺酸、高牛磺酸和 β- 丙氨酸。
• BfGAD_WT和 BfGAD_D104N在混合底物池中产生神经调节分子的丰度存在差异：在混合底物竞争实验中，研究发现 BfGAD_WT和 BfGAD_D104N在面对不同比例的底物时，产生神经调节分子的种类和数量会发生变化，且在混合底物环境中，L - 谷氨酸的脱羧反应速度最快。

研究结论表明，BfGAD_WT是一种具有底物多 promiscuity 的酶，能够脱羧多种与 L - 谷氨酸结构相似的底物，生成多种已知的神经调节分子。通过合理的酶工程改造，研究人员成功获得了牛磺酸产量翻倍的 BfGAD 变体。这一研究成果为开发新型生物催化剂、探索神经疾病的治疗应用以及扩大肠道微生物酶促生产神经调节化合物的规模开辟了新的途径。未来的研究将聚焦于在动物模型中探究这些 BfGAD 衍生的神经调节化合物的生理意义，以及进一步优化 BfGAD 的特异性和催化效率，为神经疾病的治疗提供更有效的策略。