揭秘细胞有丝分裂准备：CDK1 渐激活的关键意义

在细胞生物学研究中，为探究 DNA 复制与有丝分裂的联系，研究人员以细胞周期为主题开展研究。他们发现有丝分裂激酶的逐渐激活可确保 CDK1 依赖性转录，且激活时间影响有丝分裂进程。该研究揭示了细胞有丝分裂准备的调控机制，意义重大。

　　在细胞的奇妙世界里，细胞分裂就像一场精密的演出，它是细胞增殖的基础，对维持基因组完整性至关重要。在这个过程中，有一个神秘的阶段 ——G₂期，它处于 DNA 复制和细胞分裂之间，像是一个准备室，细胞在这里为即将到来的有丝分裂做各种准备。然而，长久以来，G₂期为何常常持续数小时，一直是困扰科学家们的谜题。

最初，人们猜测 G₂期是为了蛋白质合成，尤其是帮助触发有丝分裂的周期蛋白（Cyclins）的合成。但后来的研究却发现，G₂期的蛋白质合成并非有丝分裂进入的严格必需条件。更令人疑惑的是，抑制 Wee1 蛋白居然能迫使细胞在进入 G₂期之前就进入有丝分裂，这让 G₂期的存在意义变得更加扑朔迷离。

有丝分裂的启动由 Cdk1（周期蛋白依赖性激酶 1）与周期蛋白 A 或 B 结合形成的复合物触发。Cdk1 的活性在 DNA 复制进行时被抑制，确保细胞不会在 S 期（DNA 合成期）就错误地启动有丝分裂。一旦 DNA 复制完成，Cdk1 的活性便开始逐渐上升，从 S/G₂边界开始，这种低水平的活性在整个 G₂期持续增加，最终以指数方式增长，从而触发有丝分裂。Cdk1 活性的增加得益于多个反馈回路，这些反馈回路让 Cdk1 像一个双稳态开关，一旦启动激活，就会持续进展直至达到高活性稳态，但这个过程为何需要数小时，仍然未知。

为了解开这些谜团，来自瑞典卡罗林斯卡学院（Karolinska Institutet）的研究人员 Karen Akopyan、Zhiyu Hao 和 Arne Lindqvist 开展了深入研究。他们的研究成果发表在《iScience》杂志上，为我们揭示了细胞有丝分裂准备阶段的重要调控机制。

研究人员主要运用了实验和数据驱动的数学模型两种关键技术方法。在实验方面，他们使用多种细胞系，通过添加小分子激酶抑制剂、进行免疫荧光实验和 RNA 测序等手段，来观察细胞周期相关蛋白和基因表达的变化。在数学模型构建上，基于实验数据，利用普通微分方程（ODE）模型，模拟细胞周期中各关键蛋白的动态变化和相互作用。

Cdk1 调节 G₂期 Cyclin B1 积累
研究人员首先探究有丝分裂激酶在 G₂期逐渐激活的重要性。他们以 Cyclin B1 作为受调控的有丝分裂蛋白的代表，通过在 U2OS Cyclin B1-YFP 细胞系中添加小分子激酶抑制剂，如 Cdk1 抑制剂（RO3306）、Cdk2 抑制剂（NU6140）和 Plk1 抑制剂（BI2536），并利用计算机模拟同步化方案分析 Cyclin B1-YFP 的积累情况。结果发现，Cdk2 在 S 期就为 Cyclin B1 的积累提供了基线，而 Cdk1 和 Plk1 的活性则在 G₂期促进了 Cyclin B1 水平的增加。进一步使用免疫荧光技术在 U2OS Cdk1^as细胞中证实，Cdk1 活性确实能提高 G₂期 Cyclin B1 的水平。

Cdk1 刺激有丝分裂因子和促进自身活性的蛋白质合成
研究人员通过实验表明，Cdk1 抑制会影响 Cyclin B1 的产生。用翻译抑制剂环己酰亚胺（CHX）和 Cdk1 抑制剂 RO3306 处理细胞后发现，RO3306 能降低 Cyclin B1 水平。对同步化的 HeLa 细胞进行 RNA 测序分析，发现 RO3306 处理后，G₂期的 Cyclin B1（CCNB1）、Aurora A（AURKA）、Plk1、Greatwall（MASTL）和 Cyclin A2（CCNA2）等 mRNA 水平均降低。通过基因本体（GO）分析还发现，Cdk1 活性在 G₂期能刺激多种参与有丝分裂调控的蛋白质的产生。这表明 Cdk1 在 G₂期不仅能刺激具有有丝分裂功能的蛋白质转录，还能促进那些进一步激活 Cdk1 的蛋白质的转录。

数学模型构建
为深入理解 Cdk 介导的调节反馈，研究人员构建了一个基于实验数据的数学模型。该模型综合考虑了前馈和反馈回路，模拟了 DNA 复制、Cdk2 和 Cdk1 等在细胞周期中的作用。通过拟合实验数据，模型能够较好地反映细胞周期中关键调节因子的变化趋势。模拟 Cdk1、Cdk2 或 Plk1 抑制实验，模型结果与实验数据相符，并且模型还能预测 DNA 复制起始许可减少对细胞周期的影响，验证了模型的准确性和有效性。

Wee1 抑制后有丝分裂持续时间与添加时间的关系
研究人员利用构建的模型研究 Cdk1 依赖性反馈的重要性。在模型中去除 G₂期不同时间点的 Wee1 活性，发现早期去除 Wee1 会导致有丝分裂延迟，而晚期去除则影响较小。实验中，添加 Wee1 抑制剂（MK1775、PD0166285 和 PD407824）处理表达 Cyclin B1-YFP 的细胞，结果与模型预测一致，即 Wee1 抑制导致有丝分裂提前，但细胞中 Cyclin B1-YFP 水平降低，且有丝分裂持续时间与 Wee1 抑制剂添加时间呈负相关。这表明 G₂期的正常进展和 Cdk1 的调控对有丝分裂的顺利进行至关重要。

Wee1 抑制导致 Cdk1 和 Plk1 活性解偶联
Cdk1 依赖性反馈还涉及有丝分裂激酶 Plk1 的激活，Plk1 对有丝分裂进展至关重要。模型模拟显示，G₂期早期添加 Wee1 抑制剂会导致细胞中 Cdk1 活性迅速升高，但 Plk1 活性较低；晚期添加则影响较小。实验中，用 Wee1 抑制剂处理 U2OS 细胞后，通过流式细胞术检测发现，有丝分裂细胞中 Plk1 水平和其介导的翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）的磷酸化水平均下降。此外，同时添加 Wee1 抑制剂和 Plk1 抑制剂的实验表明，当 Wee1 活性被扰动时，一旦细胞在 S/G₂期启动 Cdk1 和 Plk1 活性，Plk1 活性对于有丝分裂进入并非必需，但在 G₂期早期，Plk1 活性可能对启动 Cdk1 激活有重要作用。

Cdk1 和 Plk1 活性解偶联导致 Wee1 抑制后有丝分裂延长
研究人员使用表达基于荧光共振能量转移（FRET）的 Plk1 靶点磷酸化监测探针的 U2OS 细胞，监测有丝分裂过程中 Plk1 的活性。结果发现，G₂期早期添加 Wee1 抑制剂的细胞进入有丝分裂时 Plk1 活性较低，而晚期添加则与对照组无差异，且有丝分裂持续时间与进入有丝分裂时 Plk1 活性呈负相关。通过在 U2TR-Plk1-T210D 细胞中诱导表达组成型活性形式的 Plk1，发现可以部分挽救 Wee1 抑制后有丝分裂的延迟，这表明 G₂期 Wee1 抑制后有丝分裂延迟部分是由于缺乏活性 Plk1。

在讨论部分，研究人员指出，他们构建的数据驱动 ODE 模型揭示了 G₂期的调控逻辑，即 Cdk1 的逐渐激活确保了有丝分裂蛋白的产生和有丝分裂激酶的协调激活。Cdk1 依赖性反馈回路不仅促进了自身活性增强因子的转录，还保证了有丝分裂进展所需蛋白质的存在。同时，研究还发现 Wee1 抑制剂对有丝分裂的影响与添加时间密切相关，这为临床使用 Wee1 抑制剂提供了重要的理论依据。此外，研究结果也解释了 Wee1 抑制剂与 Plk1 抑制联合使用具有协同效应的机制，为进一步研究联合治疗策略和预测治疗效果提供了新的思路。

这项研究成果意义重大，它为我们深入理解细胞有丝分裂准备阶段的调控机制提供了关键线索，有助于我们进一步认识细胞周期调控的奥秘。同时，研究结果也为癌症治疗等领域提供了潜在的理论基础，或许未来能基于这些发现开发出更有效的治疗策略，对抗那些与细胞周期异常相关的疾病 。