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本文揭示了 HOOKLESS 1（HLS1）在植物衰老调控中的关键作用。研究发现，HLS1 通过与 AUTOPHAGY8（ATG8）互作，负调控 ABNORMAL SHOOT 3（ABS3）介导的衰老通路，且其在拟南芥和小麦中功能保守。该研究为植物衰老调控机制提供了新见解。
HLS1 在植物衰老调控中的关键作用研究
植物衰老作为植物生命周期的重要阶段，受多种内外因素精细调控，这一过程涉及细胞成分的有序降解以及基因表达谱的大规模重编程。然而，目前对于植物衰老的遗传调控网络仍有诸多未知。本研究聚焦于 HLS1 在植物衰老调控中的作用，深入剖析其分子机制，为理解植物衰老过程提供了新的视角。
HLS1 负向调控拟南芥衰老进程
研究人员利用碳剥夺（C-deprivation）诱导拟南芥幼苗衰老的实验体系，从诱变的拟南芥突变体库中筛选出了衰老进程改变的突变体。其中，hls1 - 101、hls1 - 102 和 hls1 - 1 三个 HLS1 基因突变体在碳剥夺处理 6 天后，相较于野生型（WT），叶片衰老明显加速，表现为叶绿素含量降低，衰老相关基因（SAGs）如 STAY - GREEN 1（SGR1）和 ORESARA 1（ORE1）的表达显著上调。自然衰老实验也得到了类似结果。通过构建表达 N 端 GFP 融合 HLS1（GFP - HLS1）的转基因植株，发现其能够成功互补 hls1 - 1 的加速衰老和 “hookless” 表型；在野生型背景下过表达 GFP - HLS1，可延迟衰老并减弱 SAGs 的诱导。而 C 端 GFP 融合的 HLS1 - GFP 则无法互补 hls1 - 1 的表型，表明 GFP 标签位置可能影响 HLS1 功能。这些结果确凿地表明，HLS1 是拟南芥衰老的负向调控因子。
HLS1 的亚细胞定位新发现
以往研究多认为 HLS1 定位于细胞核，但本研究发现其存在更广泛的亚细胞定位。通过在拟南芥叶肉原生质体中瞬时表达 GFP - HLS1，并与多种内膜标记蛋白共表达，结合共聚焦显微镜观察及生化分析，证实 HLS1 不仅存在于细胞核，还定位于质膜和内体。在原生质体中，GFP - HLS1 信号与晚期内体（LE）标记 mScarlet - ARA7、mCherry - Rha1 以及早期内体（EE）标记 mScarlet - SYP61 部分重叠；在根细胞中，GFP - HLS1 与 mCherry - ARA7 和 mCherry - VTI12 也有一定程度的共定位。此外，免疫印迹实验进一步从生化角度验证了 HLS1 在细胞核和细胞质中的存在，揭示了 HLS1 在植物细胞中的非核定位现象及其功能意义。
HLS1 与自噬通路协同调控衰老
鉴于 HLS1 部分定位于内体，而内体与自噬通路密切相关，研究人员探究了 HLS1 与自噬通路的功能联系。利用 atg7 - 3 和 atg5 - 1 这两个自噬体形成必需基因的功能缺失突变体，进行遗传互作分析。结果显示，hls1 - 1 atg7 - 3 和 hls1 - 1 atg5 - 1 双突变体在碳剥夺实验和自然衰老过程中，叶片衰老表型比各自的单突变体更为显著，表现为叶绿素含量进一步降低，SAGs 表达更强。这表明 HLS1 和经典自噬通路在调控植物衰老过程中具有协同作用。有趣的是，过表达 HLS1 能够抑制 atg7 - 3 和 atg5 - 1 突变体的过早衰老，暗示 HLS1 在缺乏功能性自噬的情况下，仍可通过其他途径调节植物衰老。
HLS1 参与 ABS3 介导的衰老通路
已知 LE 定位的 ABS3 亚家族蛋白是植物衰老的正向调控因子。研究发现，mCherry - ABS3 和 GFP - HLS1 在原生质体中共表达时，信号在 LE 处有明显重叠。通过构建 hls1 - 1 mateq（ABS3 亚家族基因四突变体）、hls1 - 1 arf2 - 20、hls1 - 1 pif5 - 10 pif4 - 2 等多突变体以及在 abs3 - 1D 背景下过表达 HLS1 的转基因植株，进行遗传互作分析。结果表明，mateq、arf2 - 20 和 pif5 - 10 pif4 - 2 能够抑制 hls1 - 1 的加速衰老表型，而 hls1 - 1 abs3 - 1D 双突变体的早期衰老表型比单突变体更明显，过表达 HLS1 则可缓解 abs3 - 1D 的过早衰老。这些结果充分说明 HLS1 是 ABS3 介导的衰老通路的组成部分，且在该通路中发挥负向调控作用。
HLS1 与 ATG8 的相互作用及机制
前期研究表明 ABS3 与 ATG8 相互作用促进衰老，而 HLS1 和 ABS3 均能定位于 LE，推测 HLS1 可能与 ABS3 或 ATG8 存在相互作用。双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co - IP）实验结果显示，HLS1 与 ABS3 无直接相互作用，但与 ATG8 存在直接相互作用。在 BiFC 实验中，YN - HLS1 和 YC - ATG8e 共表达产生的 YFP 信号主要定位于质膜和内体，而非细胞核；pull - down 和 Co - IP 实验进一步证实了两者的相互作用。通过预测 HLS1 中潜在的 ATG8 相互作用基序（AIM）并进行突变分析，发现多个 AIM 基序参与了 HLS1 与 ATG8e 的相互作用，且这些 AIM 基序对 HLS1 调控植物衰老至关重要。
HLS1 抑制 ABS3 - ATG8 相互作用及 ABS3 的降解
由于 HLS1 和 ABS3 在衰老调控中的相反作用且都与 ATG8 相互作用，研究人员深入探究了 HLS1 对 ABS3 - ATG8 相互作用的影响。BiFC 实验表明，共表达 HA - HLS1 会显著减少 YN - ABS3 和 YC - ATG8e 共表达时显示 YFP 信号的细胞比例；免疫沉淀实验也证实，MBP - HLS1 的存在会降低 GST - ATG8e 与 ABS3 - GFP 的共免疫沉淀量，表明 HLS1 抑制了 ABS3 与 ATG8e 的相互作用。在碳剥夺条件下，ABS3 会被转运至液泡降解，而 HLS1 的存在显著减少了 ABS3 - GFP 在液泡中的积累，通过免疫印迹分析也发现 HLS1 过表达会减弱 ABS3 - GFP 的降解。这些结果表明，HLS1 通过干扰 ABS3 - ATG8 相互作用，抑制了 ABS3 向液泡的转运和降解，进而负向调控植物衰老。
C - deprivation 诱导 HLS1 蛋白降解
在研究 ABS3 降解过程中，研究人员发现 C - deprivation 处理会导致 HA - HLS1 水平显著降低。进一步研究表明，在 hls1 - 1 p35S:GFP - HLS1 转基因植株中，C - deprivation 处理 2 小时后，GFP - HLS1 的积累量急剧下降，且随着处理时间延长持续减少。蛋白酶体抑制剂 MG132 和液泡半胱氨酸蛋白酶抑制剂 E - 64d 能够部分缓解 GFP - HLS1 水平的下降，共聚焦显微镜观察也发现这两种抑制剂可部分恢复 GFP - HLS1 的荧光信号。这表明 C - deprivation 通过蛋白酶体和液泡降解途径诱导 HLS1 降解，暗示 HLS1 的蛋白稳定性受衰老触发信号的调控。
拟南芥 HLS1 与小麦 TaHLS1 功能的保守性
为探究 HLS1 在植物衰老调控中的保守性，研究人员在小麦中鉴定出与拟南芥 HLS1 同源的基因 TaHLS1。GFP - TaHLS1 在原生质体中的定位模式与拟南芥 HLS1 相似，定位于细胞核、质膜和内体。在拟南芥 hls1 - 1 突变体和野生型背景下过表达 GFP - TaHLS1，均能有效延迟衰老，且 TaHLS1 在 BiFC 实验中与 AtATG8e 和 TaATG8d 均有相互作用。此外，TaHLS1 还能互补 hls1 - 1 的 hookless 表型，表明 TaHLS1 和拟南芥 HLS1 在调控衰老和顶端弯钩形成方面功能保守，进一步支持了 HLS1 - ATG8 - ABS3 模块在植物中的保守性。
研究总结与展望
本研究揭示了 HLS1 在植物衰老调控中的重要作用及分子机制。HLS1 作为植物衰老和 ABS3 介导的衰老通路的负向调控因子，通过与 ATG8 相互作用，抑制 ABS3 - ATG8 相互作用以及 ABS3 的液泡降解，从而延缓衰老。C - deprivation 诱导 HLS1 降解，使其对 ABS3 - ATG8 相互作用的抑制作用减弱，进而促进衰老。此外，拟南芥 HLS1 和小麦 TaHLS1 在功能上具有保守性，表明 HLS1 - ATG8 - ABS3 模块在植物衰老调控中可能具有普遍意义。然而，本研究仍存在一些局限性。例如，不同定位的 HLS1 在衰老调控中的具体作用差异尚不明确，HLS1 如何协调自噬和 ABS3 介导的衰老途径有待进一步探究，HLS1 与 ATG8 相互作用的分子机制也需要更深入的研究。此外，验证 HLS1 同源基因在作物衰老调控中的作用，并探索通过操纵 HLS1 改善作物衰老性状的可行性，将是未来研究的重要方向。这些研究有望为深入理解植物衰老调控网络提供更多线索，为农业生产中优化作物生长和提高产量提供理论依据。
