评估流感疫苗在尘螨诱导的慢性过敏性哮喘小鼠模型中的保护作用及角鲨烯水包油乳液作为佐剂候选物的评价

《Respiratory Research》：Evaluation of the influenza vaccine protection in the house dust mite-induced chronic allergic asthma mice model and the evaluation of squalene oil in water emulsion as an adjuvant candidate

为探究哮喘对流感疫苗效果的影响及 AddaVax?作为佐剂的功效，济州国立大学研究人员用尘螨诱导哮喘小鼠模型展开研究。结果显示哮喘小鼠免疫反应不同，AddaVax?可增强抗病毒保护但引发嗜酸性粒细胞浸润，为疫苗策略开发提供依据。

　　在全球范围内，哮喘这一慢性气道炎症性疾病正影响着约 3 亿人。它不仅会导致气道免疫状态改变和结构重塑，还使患者在感染流感病毒后，出现严重并发症的风险大幅增加。在 2009 年甲型 H1N1 流感大流行期间，哮喘成为美国及全球范围内因感染该病毒而住院患者中最常见的基础疾病之一 。尽管流感疫苗对哮喘患者意义重大，但目前关于疫苗有效性以及哮喘患者针对病毒感染的 T 细胞详细功能研究却十分有限。同时，流感病毒作为一种高度易变的单链 RNA 病毒，每年都有新毒株出现，这使得开发能有效覆盖同源和异源毒株的疫苗变得极为迫切，对哮喘患者而言更是如此。

为了深入了解哮喘状态对流感疫苗保护反应的影响，以及评估 AddaVax?（一种与 MF59 类似的佐剂）在哮喘小鼠中的疫苗效果，济州国立大学的研究人员开展了相关研究。研究成果发表在《Respiratory Research》上，为流感疫苗的开发和应用提供了重要参考。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，构建尘螨（HDM）诱导的慢性过敏性哮喘小鼠模型，通过每周 5 天、持续 6 周向 6 周龄雌性 BALB/c 小鼠鼻内注射 HDM 提取物来实现。之后，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中抗原特异性免疫球蛋白水平、血凝抑制滴度，以及细胞因子和趋化因子水平；运用流式细胞术检测细胞表型、细胞内细胞因子染色和 T 细胞亚群；通过肺组织的组织病理学检查（H&E 染色和改良刚果红染色）评估炎症和嗜酸性粒细胞浸润；采用肺病毒滴定法测定肺组织中的病毒滴度。

研究结果如下：

1. HDM 诱导的哮喘小鼠模型特征：经 6 周 HDM 诱导，小鼠成功表现出过敏性哮喘的典型特征。血清中 HDM 特异性 IgE、TNF-α、IL-12p40 和 IL-4 水平显著升高，肺组织出现炎症细胞浸润、黏液堵塞，气道和肺泡结构改变。同时，肺和支气管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞、单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞数量明显增加，其中嗜酸性粒细胞增加最为显著。此外，哮喘小鼠肺中效应记忆 CD4? T 细胞数量增多，但 HDM 再刺激后产生 IFN-γ 或 IL-4 的 CD4? T 细胞百分比降低，而耗竭的 CD4?和 CD8? T 细胞百分比显著增加。
2. 疫苗免疫反应和 HI 滴度：研究人员给小鼠接种 A/PR8 流感疫苗，部分添加 AddaVax?佐剂。结果显示，接种疫苗后，正常小鼠和哮喘小鼠血清中 IgG 和 IgG1 水平均升高，且两组间抗体水平无显著差异。AddaVax?佐剂能有效增强 IgG 和 IgG1 水平，但对 IgG2a 无明显影响。尽管正常小鼠和哮喘小鼠接种疫苗后 A/PR8 特异性血清 IgG 和 IgG1 水平相似，但哮喘小鼠接种疫苗后的血清 HI 滴度明显低于正常小鼠。而添加 AddaVax?佐剂后，正常小鼠和哮喘小鼠的抗体反应和 HI 滴度均得到增强。
3. 疫苗对同源病毒攻击的保护效果：用 2.5 LD₅₀的 A/PR8 H1N1 病毒攻击接种疫苗的小鼠。正常小鼠接种疫苗后，无论是否添加佐剂，都表现出良好的保护效果，体重无明显下降，存活率达 100%，肺病毒滴度显著降低。哮喘小鼠接种疫苗后，存活率虽为 100%，但接种疫苗且感染病毒的哮喘小鼠体重明显下降，肺病毒滴度高于正常小鼠接种疫苗且感染病毒的组。而添加 AddaVax?佐剂的哮喘小鼠体重无下降，肺病毒滴度较低，保护效果优于未添加佐剂的哮喘小鼠。
4. 疫苗对炎症细胞和组织病理学的影响：感染后 5 天检测发现，正常小鼠接种疫苗且感染病毒的组和添加 AddaVax?佐剂且感染病毒的组，肺中 IL-6 和颗粒酶 B 水平降低；哮喘小鼠感染病毒的组中 TNF-α、IL-6 和 IFN-γ 水平较高；添加 AddaVax?佐剂的哮喘小鼠感染病毒的组中这些细胞因子水平降低。在 BALF 中，细胞因子水平变化趋势与肺中相似。此外，正常小鼠接种疫苗且感染病毒的组和添加 AddaVax?佐剂且感染病毒的组，肺中单核细胞和中性粒细胞百分比降低；哮喘小鼠添加 AddaVax?佐剂且感染病毒的组中单核细胞数量明显减少。肺组织病理学检查显示，正常小鼠接种疫苗且感染病毒的组炎症程度较轻，添加 AddaVax?佐剂且感染病毒的组炎症程度有所增加；哮喘小鼠感染病毒的组炎症严重，添加 AddaVax?佐剂且感染病毒的组炎症程度减轻。同时，添加 AddaVax?佐剂的正常小鼠和哮喘小鼠感染病毒的组中，肺中嗜酸性粒细胞浸润增加，哮喘小鼠添加 AddaVax?佐剂且感染病毒的组中 A/PR8 特异性 IgE 水平显著升高。
5. T 细胞亚群变化：感染后 10 天检测发现，接种疫苗后，正常小鼠和哮喘小鼠肺和脾脏中 CD4? T 细胞百分比增加，CD4、CD8 双阴性（DN）细胞百分比降低。但哮喘小鼠感染病毒后，肺和脾脏中 DN 细胞百分比高于正常小鼠，且肺中 CD8? T 细胞百分比低于正常小鼠接种疫苗且感染病毒的组。

研究结论和讨论部分指出，哮喘会降低 A/PR8 疫苗对同源流感感染的保护效果，可能与抗体亲和力降低、抗体反应偏移或 HDM 诱导的记忆 B 细胞产生非中和抗体有关。同时，哮喘小鼠在应对病毒挑战时，免疫细胞亚群存在差异，如 DN 细胞百分比增加。AddaVax?佐剂虽能增强疫苗的抗病毒保护作用，但会引发嗜酸性粒细胞浸润，这可能导致过敏反应，存在潜在风险。该研究有助于理解哮喘对流感疫苗免疫反应的影响，为开发针对健康人群和哮喘患者的病毒疫苗策略提供了重要依据。然而，研究存在一定局限性，未来还需进一步研究抗体亲和力、其他免疫细胞功能以及不同疫苗配方，以优化哮喘患者的疫苗开发 。