基于CRISPR的胞嘧啶碱基编辑器开发用于限制修饰系统失活以提升弧菌转化效率

本研究针对海洋弧菌Vibrio sp. dhg遗传改造效率低的问题，开发了高效的CRISPR-CBE系统，通过多重碱基编辑靶向失活限制酶基因，使转化效率提升55.5倍，为宏藻生物精炼提供了强大的基因编辑工具。

　　

海洋微生物因其独特的代谢能力成为生物技术研究的热点，其中Vibrio sp. dhg因其快速生长、耐高盐及降解藻酸盐的特性，被视为宏藻生物精炼的理想宿主。然而，该菌株遗传操作效率受限于其限制修饰系统（RM系统）对外源DNA的切割作用，严重阻碍了工程化改造进程。传统基因编辑方法依赖双链断裂修复，效率低且操作复杂，而新兴的碱基编辑技术虽能实现无断裂单碱基修改，但在Vibrio sp. dhg中尚未建立。

针对这一瓶颈，浦项科技大学与仁荷大学的研究团队开发了基于CRISPR的胞嘧啶碱基编辑器（CBE），通过融合失活Cas9（dCas9）、海七鳃鳗胞嘧啶脱氨酶（PmCDA1）和尿嘧啶糖苷酶抑制剂（UGI），构建了双质粒表达系统（pCBE2和psgRNA）。该系统利用sgRNA引导dCas9-CDA-UGI复合物靶向基因组特定位点，在PAM序列上游16-20 bp窗口内实现C:G-to-T:A的高效转换，并通过引入终止密码子实现基因失活。研究发表于《Journal of Biological Engineering》，为海洋微生物的精准编辑提供了新范式。

关键技术包括：1）双质粒CBE系统的构建与优化；2）基于Golden Gate组装的模块化sgRNA设计；3）靶向RM系统7个限制酶基因的多重编辑策略；4）电转化效率的定量评估。

结果

1. CBE系统功能验证
   靶向rpoB（S531F突变）和pyrF（W83*突变）的编辑效率达50%-100%，UGI显著提升编辑效率。突变株表现出预期的利福平和5-FOA抗性，证实CBE2系统的高效性。

2. 多重编辑失活RM系统
   通过两轮编辑，分别靶向RE1（4个基因）和RE2（3个基因），成功获得完全失活7个限制酶的RE3菌株。编辑效率呈现位点差异性（12%-100%），其中RE0-2（mrr）和RE0-7（III型内切酶）效率最高。

3. 转化效率提升
   RE1（47.6倍）和RE3（55.5倍）菌株的转化效率显著提高，但RE2（9.1倍）贡献有限，表明REBASE预测的RE1靶点是限制转化的主要屏障。

4. 基因组编辑覆盖度分析
   89.89%的基因可通过SpCas9靶向，SpG（NGN PAM）和SpRY（近PAMless）变体将覆盖率提升至99.59%，其中84.87%的基因可在编码区前50%引入终止密码子。

结论与意义
该研究首次在Vibrio sp. dhg中建立高效CBE系统，突破RM系统对遗传操作的制约。通过理性设计sgRNA和模块化组装策略，实现了多重基因失活，为复杂代谢通路重构奠定基础。工程菌株55.5倍的转化效率提升，显著加速了宏藻资源利用的菌株开发进程。研究还揭示了PAM灵活性对编辑覆盖度的关键影响，为后续开发PAMless编辑器提供方向。这一工具包不仅推动海洋微生物合成生物学发展，也为其他非模式菌的遗传改造提供了技术模板。