功能性钴掺杂水凝胶支架：促进血管化与神经发生的创新突破

《Journal of Nanobiotechnology》：Functional cobalt-doped hydrogel scaffold enhances concurrent vascularization and neurogenesis

为解决组织再生中血管和神经难以协同生长的问题，研究人员开展了关于三维明胶甲基丙烯酰化 - 多壁碳纳米管 / 钴（GelMA-MWCNTs/Co）水凝胶的研究。结果显示该水凝胶能促进血管生成和神经发生，为组织再生提供了新策略。

　　在生物医学领域，组织修复与再生一直是备受关注的热点话题。当身体遭受创伤，如严重的外伤或肿瘤切除后，组织缺损问题接踵而至，这不仅会导致血管和神经受损，还会严重阻碍受损组织和器官的功能恢复。目前，虽然自体组织移植被视为较为有效的治疗手段，但优质供体组织的稀缺以及供体部位可能出现的并发症，极大地限制了其广泛应用。而基于干细胞的组织工程技术虽前景广阔，却面临着一个棘手的难题：在复杂的缺损部位，难以实现血管和神经的同步重建。这是因为血管和神经网络之间存在着紧密的相互作用，它们负责运输营养物质、细胞因子和神经递质，对组织的再生起着关键作用。同时，由于氧气和营养物质从毛细血管自然扩散的距离有限，位于支架中心区域的细胞常常因得不到充足的供应而活力受损。因此，开发一种能够同时促进功能性血管化和神经支配的有效策略，成为了生物医学领域亟待攻克的难题。

为了应对这一挑战，中山大学光华口腔医学院附属口腔医院（广东省口腔医学重点实验室）等研究机构的研究人员开展了深入研究。他们致力于开发一种新型材料，期望能为组织再生带来新的突破。最终，研究人员成功制备出一种三维明胶甲基丙烯酰化 - 多壁碳纳米管 / 钴（GelMA-MWCNTs/Co）水凝胶支架，并对其在促进血管化和神经发生方面的作用进行了系统研究。研究发现，这种水凝胶能够实现钴离子（Co²⁺）的持续释放，模拟缺氧环境，有效促进了血管生成和神经发生。该研究成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》上，为基于干细胞的组织再生提供了重要的理论依据和实践指导，有望推动再生医学领域的重大进展。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过特定的化学合成方法制备了 GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶。然后，利用扫描电子显微镜（SEM）、能量色散 X 射线光谱（EDX）等技术对水凝胶的形态和元素分布进行表征。此外，采用细胞共培养实验、酶联免疫吸附测定（ELISA）、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）、免疫荧光（IF）等技术，从细胞和分子水平研究水凝胶对细胞行为、相关因子表达以及血管和神经形成的影响。在体内实验方面，构建小鼠移植模型，通过组织学染色和免疫组化分析，评估水凝胶在体内促进血管化和神经发生的效果。

水凝胶的合成与表征

研究人员成功合成了 GelMA 和 GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶。SEM 图像显示，两种水凝胶均呈现出特征性的蜂窝状结构，且 GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶表面存在 MWCNTs/Co 复合材料。EDX 分析证实了 Co 离子在 GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶中均匀分布。Co 离子释放实验表明，GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶在初始阶段有 Co 离子的突释，随后释放速度明显降低且更可控。流变学特性和压缩应力 - 应变曲线显示，GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶的储能模量（G′）、损耗模量（G″）更高，机械强度更强。体外降解实验发现，GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶的降解速度比 GelMA 水凝胶慢。

水凝胶的体外生物相容性

将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和根尖乳头干细胞（SCAP）在 GelMA 和 GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶中共培养。活 / 死染色结果显示，培养 7 天后，两种水凝胶中的细胞活力均较高，且 GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶组与 GelMA 组的细胞活力无显著差异，表明 GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶具有良好的生物相容性。CCK-8 实验表明，在培养第 7 天，GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶组的细胞增殖明显增加，说明该水凝胶能有效支持细胞黏附并促进 HUVECs 和 SCAP 的增殖。

GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶对 HUVECs 血管生成活性的影响

通过 Western blot、ELISA 和 RT-qPCR 检测发现，与 GelMA 水凝胶相比，GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶能显著提高 HIF-1α 蛋白表达，促进 VEGF 分泌。在 3D 共培养体系中，GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶组的血管生成相关基因表达上调，表明该水凝胶可模拟缺氧环境，激活 HIF-1α 通路，促进 VEGF 分泌，进而推动血管形成。

GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶加速体外血管样网络形成

将 HUVECs 和 SCAP 在 3D GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶中直接共培养，观察到在培养第 7 天和第 14 天，GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶中的血管样网络更为复杂，血管长度和连接密度增加。此外，SCAP 可分化为表达平滑肌细胞特异性标记 SM22α 的细胞，并参与血管结构的稳定和成熟。

共培养生成神经血管结构

将电刺激诱导的 SCAP（iSCAP）微球与 HUVECs 和 SCAP 在不同水凝胶中共培养 7 天。结果显示，含有 MWCNTs/Co 的水凝胶组（GelMA/Co-ES 和 GelMA/Co + ES 组）中，iSCAP 微球的神经突样结构生长和延伸更显著，血管样结构发育也明显增强。RT-qPCR 分析表明，GelMA/Co + ES 组中神经标记基因（Tuj1、MAP2、NeuN）和血管生成相关基因（VEGF）以及神经营养因子（NGF、BDNF）的表达均显著上调，证实了该水凝胶促进神经分化和血管生成的协同作用。

GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶在体内加速血管生成和神经发生

将 iSCAP 微球、HUVECs 和 SCAP 在 GelMA 或 GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶中共培养 7 天后，植入 SCID 小鼠皮下。H&E 染色显示，GelMA/Co + ES 组的血管整合效果最佳，灌注血管密度更高。IHC 分析和免疫荧光分析表明，该组的微血管形成更多，iSCAP 神经分化增强，进一步证明了 GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶在体内促进血管生成和神经发生的能力。

综上所述，本研究成功开发了一种模拟缺氧的 GelMA-MWCNTs/Co 水凝胶，其能够实现钴离子的可控释放，并在体外和体内实验中均表现出促进血管化和神经支配的良好效果。这种水凝胶为组织工程和再生医学提供了一种极具潜力的材料，有望推动基于干细胞的组织再生治疗的临床应用。然而，研究也存在一定局限性，如未使用脊髓损伤模型评估水凝胶功能，共培养实验中生长因子的细胞来源尚不明确等。未来研究可针对这些问题进一步深入探索，以更全面地揭示血管和神经相互作用的机制，为组织再生领域的发展提供更坚实的理论基础和技术支持。