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为解决拉科罗病毒（LACV）现有诊断方法在灵敏度、特异性和可及性方面的局限，研究人员开展了开发用于 LACV 检测的逆转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）检测方法及探究其年龄相关神经侵袭和清除动态的研究。结果显示该方法高效、特异、灵敏，且发现成年与幼年小鼠感染 LACV 后神经侵袭和清除存在差异，为诊断和治疗提供了新方向。
拉科罗病毒（La Crosse virus，LACV）是一种通过蚊子传播的虫媒病毒，在北美地区引发小儿脑炎，主要影响 16 岁以下儿童。它属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）的单链负义病毒，拥有独特的三段基因组，分别编码不同功能的蛋白。该病毒自 20 世纪 60 年代在威斯康星州拉克罗斯被发现后，一直流行于北美中西部和东部地区。
目前，LACV 的诊断面临诸多挑战。传统的逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）虽然在病毒血症高峰期灵敏度和特异性较高，但随着病毒滴度下降，其效用降低。血清学工具，如酶联免疫吸附试验（ELISA），虽能检测 LACV 特异性抗体，但常需进行空斑减少中和试验（PRNTs）来区分与其他相关病毒的感染，操作繁琐，且缺乏商业化的 LACV 特异性检测试剂，限制了这些方法在资源有限地区的应用。此外，LACV 在不同年龄宿主中的致病性差异也有待深入研究，其在小鼠模型中表现出年龄相关的疾病严重性，然而关于 LACV 神经侵袭中枢神经系统（CNS）和大脑的时间动态数据却十分有限。
为解决这些问题，罗格斯大学（Rutgers University）的研究人员开展了一系列研究。他们开发并验证了一种用于检测 LACV 的 RT-RPA 检测方法，同时利用年龄易感性小鼠模型，研究 LACV 在大脑中的感染时间进程，探索宿主年龄对神经侵袭和病毒清除的影响。该研究成果发表在《Virology Journal》上。
研究人员在开展研究时，主要运用了以下关键技术方法：首先，通过多序列比对和引物设计筛选，针对 LACV 基因组的 M 片段设计引物；然后，提取病毒 RNA 并进行 cDNA 合成，用于后续的引物筛选、检测限（LOD）测试和交叉反应筛选；接着，进行 RT-RPA 反应，使用未标记引物和标记引物的反应，并通过琼脂糖凝胶电泳和侧向流动分析（LFA）检测产物；此外，利用小鼠模型，对幼年（3 周龄）和成年（8 周龄）小鼠进行 LACV 感染实验，在不同时间点收集大脑样本，通过 RT-qPCR 和新开发的 RT-RPA 检测方法评估病毒感染情况 。
筛选 RT-RPA 引物对用于 LACV 检测
研究人员对加利福尼亚血清群（CSG）病毒的 S、M 和 L 片段进行百分比同一性矩阵分析，发现 M 片段在 LACV 与其他 CSG 病毒之间的序列差异最大，于是选择 M 片段作为 LACV 特异性引物设计的靶点。经过对多对引物的筛选，最终确定引物对 3 在 39℃下扩增效果最佳，其扩增产物为 208 碱基对（bp），可用于后续优化实验。
评估 LACV RT-RPA 扩增时间、分析灵敏度和特异性
通过时间进程研究确定，RT-RPA 检测 LACV 的最佳孵育时间为 20 分钟。利用十倍系列稀释的 LACV RNA 评估检测限，结果显示该检测方法的 LOD 为 100 拷贝，与 RT-qPCR 检测方法相当。对其他虫媒病毒进行交叉反应测试，结果表明该引物对特异性良好，不会对雪兔病毒（SSHV）、登革热病毒（DENV）1 - 4 型、寨卡病毒（ZIKV）、西尼罗河病毒（WNV）和黄热病病毒（YFV）等病毒产生扩增反应。
将 LACV RT-RPA 检测与 LFA 整合
为实现 LACV 的即时检测（point-of-care diagnosis），研究人员开发了一种与 LACV RT-RPA 检测相结合的 LFA。实验结果显示，该 LFA 的 LOD 同样为 100 拷贝，且对其他相关虫媒病毒无交叉反应，表明其可作为一种潜在的快速现场检测工具。
评估幼年和成年小鼠大脑中 LACV 的年龄依赖性检测和清除情况
研究人员用 103 PFU 的 LACV 腹腔接种幼年和成年 C57BL/6 小鼠，在不同时间点收集大脑样本进行检测。结果发现，幼年小鼠最早在感染后 4 天（dpi）大脑中就能检测到 LACV，5 - 7 dpi 时所有小鼠均可检测到，且此时出现明显的神经系统症状。成年小鼠在 5 dpi 时大脑中首次检测到 LACV，6 - 10 dpi 时病毒载量达到平台期，20 dpi 时病毒在存活小鼠大脑中完全清除。通过对 LFA 条带图像分析估计病毒载量，发现幼年小鼠在感染高峰期（4 - 5 dpi）大脑中的病毒载量明显高于成年小鼠。
研究结论和讨论部分表明，该研究开发的 RT-RPA 检测方法能够高效、灵敏且特异的检测 LACV，无论是通过琼脂糖凝胶电泳还是 LFA 检测，都表现出良好的性能，在资源受限的环境中具有重要的应用潜力。此外，研究首次详细比较了幼年和成年小鼠感染 LACV 后的神经侵袭和清除动态，发现成年小鼠的神经侵袭起始时间晚于幼年小鼠，且最终能够有效清除病毒，这可能与成年小鼠的免疫成熟度有关。虽然该研究存在一定局限性，如未使用人类临床样本进行检测，对更多共循环虫媒病毒的验证不足等，但总体而言，该研究为 LACV 的诊断和治疗提供了新的方向，有助于减轻 LACV 疾病负担，深化对虫媒病毒神经侵袭的理解。
