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为探究 TRPV4 在颞叶癫痫（TLE）焦亡中的作用，研究人员以匹鲁卡品诱导癫痫持续状态（PISE）的小鼠为对象展开研究。结果发现，抑制 TRPV4 可下调 calpain 1–NLRP3/cas-1–GSDMD 通路，减轻焦亡和神经元损伤，为癫痫治疗提供新靶点。
癫痫，这一古老而神秘的神经系统疾病，如同大脑中的 “定时炸弹”，时刻威胁着患者的健康。它由大脑神经元突然异常放电引发，其中癫痫持续状态（SE）更是会对大脑造成不可逆的损伤。在颞叶癫痫（TLE）患者和动物模型中，神经元损伤极为明显，比如在匹鲁卡品诱导的 TLE 小鼠中，SE 1 小时后海马 CA1 和 CA3 区存活的锥体细胞数量会减少 40 - 50% 。神经元损伤不仅破坏了突触结构，导致突触传递功能障碍和神经元异常放电，还会刺激海马齿状回的神经发生，引发一系列复杂的病理变化。
然而，神经元损伤背后的机制却如同迷雾，尚未完全被揭示。近年来，一种名为焦亡（pyroptosis）的程序性细胞死亡形式进入了科研人员的视野。焦亡由 gasdermin 蛋白家族介导细胞膜孔形成，在经典途径中，NOD 样受体家族含 pyrin 结构域 3（NLRP3）等炎症小体激活半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 - 1（caspase-1，cas-1），使其裂解为具有活性的 c-cas-1 ，进而切割 gasdermin D（GSDMD）产生 N 端片段（N-GSDMD） 。这些片段在细胞膜上形成孔道，导致细胞渗透压肿胀，释放促炎细胞因子如白细胞介素 - 1β（IL-1β）等，最终造成神经元损伤。在 TLE 患者和动物模型的海马中，NLRP1 和 cas-1 表达显著上调，与神经元焦亡密切相关，这表明焦亡或许是治疗癫痫的关键靶点。
同时，钙激活中性蛋白酶（calpain）在癫痫中的作用也备受关注。calpain 有 calpain 1 和 calpain 2 两种形式，广泛表达于大脑。其中，calpain 1 可使 cas-1 从细胞骨架上解离，参与炎症小体的组装和激活。在癫痫过程中，calpain 1 的表达和活性明显增加，但其是否与 NLRP3 炎症小体、cas-1 激活以及焦亡相关，仍有待研究。
此外，瞬时受体电位香草酸受体 4（TRPV4）作为一种对 Ca2+有通透性的离子通道，也与癫痫的发病机制紧密相连。生物信息学分析显示，Trpv4 是癫痫的易感基因。在癫痫小鼠中，激活 TRPV4 会通过 TRPV4–Ca2+–Yes 相关蛋白（YAP）–信号转导及转录激活因子 3（STAT3）信号通路促进神经炎症，而抑制 TRPV4 则能减轻神经炎症和神经元损伤。不过，TRPV4 激活是否会在癫痫过程中激活 calpain，尚未有报道。
为了深入探索这些未知，南京医科大学的研究人员开展了一项重要研究，相关成果发表在《Acta Neuropathologica Communications》上。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先，选用 6 周龄雄性 ICR 小鼠构建 PISE 小鼠模型，通过腹腔注射甲基东莨菪碱和匹鲁卡品诱导癫痫发作，利用 Racine 量表评估发作行为严重程度 。接着，运用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术检测海马中相关蛋白的表达水平；通过组织学检查，包括免疫荧光染色观察 GSDMD 免疫阳性（GSDMD+）细胞，甲苯胺蓝染色计数存活神经元，以及进行双重免疫染色确定焦亡发生的细胞类型；还使用了多种抑制剂和激动剂，如 TRPV4 拮抗剂 HC-067047、激动剂 GSK1016790A ，calpain 抑制剂 MDL-28170，NLRP3 抑制剂 MCC950 和 cas-1 抑制剂 Ac-YVAD-cmk，通过脑室内注射或腹腔注射给药，以探究各信号通路的变化。
PISE 后海马中 calpain、NLRP3、cas-1、IL-1β 和 GSDMD 表达的变化：研究发现，PISE 小鼠海马中，inactive/total calpain 1 比值显著降低，表明 calpain 1 活性增加，而 inactive/total calpain 2 比值变化不大。同时，NLRP3、c-cas-1、IL-1β 和 N-GSDMD 蛋白水平显著升高，GSDMD+细胞数量增多，且在神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中均观察到焦亡现象，这说明 NLRP3 炎症小体激活和焦亡是 PISE 后的关键病理变化。
calpain 抑制剂对 PISE 后 calpain 1–NLRP3/cas-1–GSDMD 信号通路的影响：给予 calpain 抑制剂 MDL-28170 后，PISE 小鼠海马中 inactive/total calpain 1 比值显著增加，有效抑制了 calpain 1 的激活。虽然 MDL-28170 对 NLRP3 蛋白水平无影响，但显著降低了 c-cas-1、IL-1β 和 N-GSDMD 蛋白水平，减少了 GSDMD+细胞数量，增加了存活神经元数量。此外，NLRP3 抑制剂 MCC950 和 cas-1 抑制剂 Ac-YVAD-cmk 也显著降低了 PISE 小鼠海马中 c-cas-1、IL-1β 和 N-GSDMD 蛋白水平，进一步证实了 NLRP3–cas-1–GSDMD 通路在 PISE 后被激活。这表明抑制 calpain 1 可下调该信号通路，抑制焦亡，改善神经元存活。
TRPV4 拮抗剂对 PISE 后 calpain 1–NLRP3/cas-1–GSDMD 信号通路的影响：使用 TRPV4 拮抗剂 HC-067047 处理 PISE 小鼠后，其海马中 inactive/total calpain 1 比值显著增加，同时 NLRP3、c-cas-1、IL-1β 和 N-GSDMD 蛋白水平降低，GSDMD+细胞数量减少，神经元存活率提高。这表明阻断 TRPV4 可能通过抑制 calpain 1–NLRP3/cas-1–GSDMD 通路，抑制焦亡，减轻神经元损伤。
TRPV4 激动剂对 calpain 1–NLRP3/cas-1–GSDMD 通路的影响：给予 TRPV4 激动剂 GSK1016790A 后，小鼠海马中 inactive/total calpain 1 比值显著降低，NLRP3、c-cas-1、IL-1β 和 N-GSDMD 蛋白水平升高，GSDMD+细胞数量增加。而给予 calpain 抑制剂 MDL-28170、NLRP3 抑制剂 MCC950 或 cas-1 抑制剂 Ac-YVAD-cmk 后，可显著降低 c-cas-1、IL-1β 和 N-GSDMD 蛋白水平。这说明 TRPV4 激活会增强 calpain 1–NLRP3/cas-1–GSDMD 通路，促进焦亡。
综合上述研究结果，该研究揭示了 TRPV4–calpain 1–NLRP3–cas-1–GSDMD 信号轴在癫痫中驱动焦亡和海马神经元损伤的关键作用。TRPV4 作为上游钙通道，选择性激活 calpain 1，引发 NLRP3 炎症小体组装和激活，进而促进 cas-1 介导的 GSDMD 裂解，导致焦亡细胞死亡。这一发现将癫痫中的 “TRPV4–calpain 1–NLRP3–焦亡” 轴与以往在缺血和代谢紊乱中报道的 calpain–NLRP3 相互作用区分开来。通过药物抑制该通路能够有效减轻海马神经元损伤，为癫痫治疗提供了新的潜在靶点，为开发针对性治疗方法减轻癫痫相关神经毒性奠定了理论基础。然而，研究也存在一些局限性，如可能存在脱靶效应、未充分考虑性别差异、未对 TLE 慢性期进行长期评估以及未探究 TRPV4 阻断对其他炎症小体的影响等，这些都为后续研究指明了方向。
