应用可复制靶向载体系统攻克难操作链霉菌的遗传改造难题

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Application of a replicative targetable vector system for difficult-to-manipulate streptomycetes

在链霉菌遗传操作中，DNA 导入效率低和同源重组频率低阻碍了部分菌株的基因改造。研究人员开展了构建和应用共轭复制载体 pDS0007 的研究。结果显示该载体能在低效结合情况下筛选出接合子，还成功用于构建突变体。这为难操作链霉菌的研究提供了新工具。

　　在微生物的奇妙世界里，链霉菌（Streptomycetes）可是相当独特的存在。它们不仅有着复杂如丝状真菌般的生命周期，更像是天然的 “药物工厂”，能生产出对医学至关重要的生物活性天然产物，特别是抗菌药物。在分子微生物学领域，科学家们一直希望通过遗传学研究，深入探索链霉菌的生物学特性和特殊代谢过程。

然而，现实却给研究人员出了道难题。部分链霉菌的遗传操作困难重重，其中 DNA 导入细胞效率低，以及同源重组（homologous recombination）频率低，成为了两大 “拦路虎”。这使得在对一些链霉菌进行基因改造时，难以稳定地将重组构建体整合到基因组中，导致研究进展缓慢。

为了解决这些问题，德国莱布尼茨微生物和细胞培养物收藏中心（Leibniz Institute DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们致力于构建一种新型载体，以突破链霉菌遗传操作的困境。

研究人员成功构建了共轭复制载体 pDS0007。该载体具备多种实用功能，它携带了 gusA 基因，编码 β - 葡萄糖醛酸酶（β -glucuronidase），可用于可视化筛选质粒的存在；同时含有 I-SceI 内切酶的识别序列，能在必要时促使载体丢失，推动 DNA 双链断裂修复，进而促进基因置换突变体的出现。

研究人员通过一系列实验对 pDS0007 进行了全面测试。在测试载体的复制区域时，发现 pDS0007 中源自 pIJ101 的复制区域缺少 sti 位点。在共轭效率测试中，与对照载体相比，pDS0007 在向伊朗链霉菌（Streptomyces iranensis）转移时，虽然效率较低，但仍能成功获得接合子。稳定性测试表明，在没有抗生素选择压力时，pDS0007 在链霉菌中极易丢失，这一特性使其在某些方面类似自杀载体。

研究人员利用 pDS0007 对伊朗链霉菌进行诱变，成功构建了 ΔpepM::neo 突变体。这一突变体的构建为研究新发现的含膦天然产物生物合成途径提供了关键证据。通过 31^P NMR 光谱分析发现，野生型伊朗链霉菌能产生含膦代谢物，而 ΔpepM::neo 突变体则丧失了这一能力，这充分证明了 pepM 基因在膦酸盐生产中的关键作用。

这项研究成果意义重大。pDS0007 载体的成功构建和应用，为难以操作的链霉菌遗传操作提供了新的有力工具，极大地推动了链霉菌相关研究的进展。它有助于科学家更深入地探索链霉菌的代谢途径，发现更多具有药用价值的天然产物，为医药领域的发展提供新的契机。该研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上。

研究人员开展研究时用到的主要关键技术方法包括：DNA 测序技术（如 Sanger 测序和牛津纳米孔技术 ONT 测序），用于测定质粒和基因组 DNA 序列；分子克隆技术，用于构建各种质粒载体；β - 葡萄糖醛酸酶检测，用于可视化筛选含载体的菌落；31^P NMR 光谱分析技术，用于检测膦酸盐的产生。

研究结果主要包括：

• pDS0007 载体的构建：以 pIJ86 为基础，插入 gusA 基因和 I-SceI 识别序列，构建出 pDS0007 载体，并对其进行测序和注释，确定了其基因组成和结构。
• pDS0007 载体相关特性研究：分析 pDS0007 中 pIJ101 复制区域，发现缺少 sti 位点；与其他载体对比，测试其向伊朗链霉菌的共轭效率，结果显示效率较低；在不同链霉菌中测试其稳定性，发现无抗生素选择时极易丢失。
• 利用 pDS0007 构建突变体：构建含 pepM 基因同源重组盒的载体 pDS0202，将其导入伊朗链霉菌，成功获得 kanamycin 抗性的接合子，并通过筛选得到 ΔpepM::neo 突变体。
• 突变体功能验证：通过 31^P NMR 光谱分析，证实野生型伊朗链霉菌产生含膦代谢物，而 ΔpepM::neo 突变体丧失该能力，证明 pepM 基因对膦酸盐生产至关重要。

研究结论和讨论部分强调，pDS0007 载体在遗传操作中表现出独特优势，虽然其丢失机制与缺少 sti 位点的关系尚不明确，但这并不影响其在构建突变体方面的有效性。该载体成功应用于伊朗链霉菌，证明了其在难操作链霉菌研究中的重要价值，为深入研究链霉菌生物合成途径和开发新型生物活性物质奠定了坚实基础。