农杆菌介导 bar 基因转化培育抗除草剂转基因番茄：优化与意义探究

《Discover Plants》：Development of herbicide-resistant transgenic tomato plants with Agrobacterium-mediated genetic transformation using bar gene

为解决番茄受多种生物和非生物胁迫影响产量，传统育种方法耗时耗力的问题，研究人员开展了农杆菌介导 bar 基因转化培育抗除草剂转基因番茄的研究。结果表明优化条件可提高转化效率，不同基因型转化效率有差异。该研究为番茄遗传改良提供了有效方法。

　　在蔬菜世界里，番茄（Solanum lycopersicum L.）可是个 “明星”。它不仅是全球各地餐桌上的常客，能做成各种美味佳肴，还富含抗氧化剂、矿物质和维生素，对人体健康益处多多。然而，番茄的生长之路并不顺利，干旱、洪涝、病虫害等生物和非生物胁迫，就像一个个 “小怪兽”，严重影响着它的产量，让全球番茄产量损失高达 40 - 80%。传统的育种方法，就像一场漫长的马拉松，耗时又耗力，难以满足人们对番茄新品种的需求。为了帮助番茄 “打败” 这些 “小怪兽”，培育出更优质的品种，印度卡卡提亚大学（Kakatiya University）的研究人员展开了一项重要研究。他们的研究成果发表在了《Discover Plants》杂志上，为番茄的遗传改良带来了新的希望。
研究人员主要采用了农杆菌介导的遗传转化技术。他们以携带 bar 基因（赋予植物对草丁膦（Phosphinothricin，PPT）的抗性）和 gusA 报告基因的农杆菌菌株 LBA4404 为工具，利用番茄子叶外植体进行转化实验。同时，运用 PCR 分析技术，检测转基因是否稳定整合到番茄基因组中；通过 GUS 组织化学分析，评估转化效率。

1. 草丁膦敏感性试验

研究人员用不同浓度的 PPT 处理番茄子叶外植体，发现 0.5mg/L 的 PPT 能有效抑制非转化子叶外植体的再生，在频繁更换新鲜培养基的情况下，该浓度适合筛选转化子。而更高浓度的 PPT，如 1.0mg/L、1.5mg/L 会使外植体切口处坏死，2.0mg/L 时外植体直接死亡。

2. 预培养时间的影响

研究发现，子叶外植体预培养 2 天可显著提高转化效率，相比新鲜制备的外植体，转化效率提升了约 3 倍。但预培养时间超过 2 天，转化效率反而降低。这可能是因为预培养时间过长会影响农杆菌细胞附着和 T - DNA 转移。

3. 乙酰丁香酮浓度的影响

乙酰丁香酮在番茄转化过程中起着关键作用。研究人员在感染和共培养培养基中添加不同浓度的乙酰丁香酮，发现 100μM 时转化频率最高，低于或高于这个浓度，转化频率都会下降。

4. 共培养时间的影响

共培养时间对转化效率也有显著影响。将感染农杆菌的子叶外植体共培养 2 天，转化效率最佳。若共培养时间超过 3 天，农杆菌过度生长会导致外植体死亡，转化频率降低。

5. 细菌细胞密度的影响

细菌细胞密度同样重要。研究人员测试了不同 OD₆₀₀值（0.2 - 1.0）的农杆菌细胞密度，发现 OD₆₀₀为 0.6 时，最适合诱导番茄子叶外植体的最高转化效率，高于这个密度，转化频率会显著下降。

6. 细菌感染时间的影响

除了细胞密度，细菌感染时间也会影响转化效率。感染时间在 5 - 10 分钟时，转化效率逐渐增加，超过 10 分钟后，转化效率急剧下降。

7. 转基因番茄植株的转化与筛选

经过共培养、清洗，外植体在含有 PPT 和头孢噻肟的培养基上培养。非转化外植体逐渐坏死，而转化外植体则开始细胞分裂和形成愈伤组织。经过多次继代培养，筛选出的转基因芽在生根培养基上生根，最终获得的转基因番茄植株表型与母株相同，且能正常开花。

8. Gus 组织化学分析

gusA 报告基因用于评估转化效率。通过观察外植体在 X - Gluc 溶液中的染色情况，发现稳定整合 gusA 基因的转化组织会呈现出强烈的蓝色，表明转化成功。

9. 转基因植株的分子鉴定

研究人员对转基因植株进行 PCR 分析，使用 bar 基因的特异性引物，扩增出了预期的 450bp 片段，证实了 bar 基因稳定整合到番茄基因组中。通过该转化方案获得的转基因番茄植株表达 bar 基因，具有除草剂抗性。

10. 基因型对转化效率的影响

研究人员还比较了不同番茄基因型（Arka Abha、Arka Meghali、Arka Rakshak、Arka Samrat 和 Pusa Ruby）的转化效率。结果发现，Arka Samrat 的转化效率最高（40.78%），其次是 Pusa Ruby（37.21%），Arka Rakshak（30.95%）、Arka Abha（30.55%）和 Arka Meghali（29.27%）的转化效率相对较低。
在这项研究中，研究人员成功建立了高效且可重复的农杆菌介导的番茄遗传转化体系。他们通过优化转化条件，确定了适合番茄转化的最佳参数，包括外植体预培养时间、乙酰丁香酮浓度、共培养时间、细菌细胞密度和感染时间等。同时，研究还发现不同基因型的番茄在转化效率上存在差异，这为后续选择合适的番茄基因型进行遗传改良提供了依据。该研究成果对于利用分子育种方法改良番茄种质，培育具有抗除草剂等优良性状的新品种具有重要意义，有望帮助番茄在面对各种胁迫时 “茁壮成长”，提高全球番茄的产量和质量，为农业生产带来新的突破。