印度即时护理点生产的抗 CD19 CAR-T 细胞疗法的安全性、有效性及总成本：VELCART 试验 —— 为中低收入国家癌症治疗带来新希望

本文报道了印度开展的 VELCART 试验，评估即时护理点（POC）制造的抗 CD19 嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）疗法。该疗法用全自动系统生产，对复发 / 难治性 B 细胞白血病和淋巴瘤患者疗效显著，安全性良好且成本低，为相关疾病治疗提供新方向。

　　### 引言
嵌合抗原受体（CAR）T 细胞疗法是治疗化疗难治性 B 细胞白血病和淋巴瘤的有效手段，靶向 CD19 的 CAR-T 细胞疗法已获美国食品药品监督管理局批准，成为复发 / 难治性（r/r）B 细胞白血病和淋巴瘤的标准治疗方案。然而，该疗法存在成本高、周转时间长等问题，即便在发达国家，患者获取治疗也受限。当前集中式生产模式无法满足发展中国家需求，分散式或即时护理点（POC）制造模式应运而生。POC 制造使用全自动处理系统，不仅能降低生产成本，减少冷链相关费用和物流挑战，而且新鲜产品可能更具活力，体内扩增更显著、更快，有望提高疗效。本研究旨在评估 POC 制造的 CAR-T 细胞的安全性、有效性和总成本，这是印度首次评估 POC 制造 CAR-T 细胞疗法可行性的临床研究，还包括医疗资源利用（HRU）分析。

结果

1. 制造抗 CD19 CAR-T 细胞：10 名患者参与本剂量递增的 1 期临床试验，包括 6 例 r/r B 细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）和 4 例弥漫大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL），中位年龄 45 岁，先前接受过中位 3 线治疗。使用 CliniMACS Prodigy 系统在院内生产临床级 CAR-T 细胞，静脉到静脉时间为 9 天，所有患者均输注新鲜 CAR-T 细胞。细胞培养中位扩增 15 倍，活力 97% ± 5%，中位转导效率 38%，平均载体拷贝数（VCN）为 1.97 ± 0.3 拷贝 / CAR-T 细胞，产品中未检测到复制型慢病毒，CD3⁺T 细胞纯度中位数达 98%，且未检测到 CD19⁺B 细胞。B-ALL 和 DLBCL 产品的 CD4/CD8 比值存在差异。
2. 起始 T 细胞和最终 CAR-T 细胞产品的表型分析：8 名患者的 CAR-T 细胞数量超过输注所需剂量，多余细胞按标准方案冷冻保存，6 个月后解冻分析显示产品中位活力为 91%。免疫表型分析发现，B-ALL 患者起始样本中 T 细胞更幼稚，DLBCL 患者效应记忆 T 细胞更多。最终 CAR-T 细胞产品中，白血病和淋巴瘤患者的中央记忆 T 细胞（CD45RO⁺CD62L⁺）显著增加，效应记忆（CD45RO⁺CD62L^?）细胞在 CD4⁺T 细胞中减少，CD8⁺T 细胞中效应细胞（CD45RO^?CD62L^?）和幼稚细胞（CD45RO^?CD62L⁺）百分比降低。DLBCL 患者产品中 LAG3⁺细胞显著增加，而 PD1 和 TIM3 等耗竭标记物不明显。
3. 制造的 CAR-T 细胞的抗肿瘤活性：将 CAR-T 细胞与靶细胞（CD19⁺细胞 NALM6）和非靶细胞（CD19^?细胞 K562）共培养，发现其接触靶细胞后，Th1 细胞因子干扰素（IFN）-γ、粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素（IL）-2 和肿瘤坏死因子（TNF）-α 显著增加，Th2 细胞因子也有少量增加。体外细胞毒性试验表明，抗 CD19 CAR-T 细胞在各效应细胞与靶细胞比例下，对靶细胞均有显著裂解作用，激活标记 CD25 和 CD137 表达证实其活化，重新刺激后 CAR-T 细胞增殖增加且极少耗竭，显示出抗原特异性效应功能和增殖能力，B-ALL 和 DLBCL 患者来源的 CAR-T 细胞抗肿瘤活性无明显差异。
4. CAR-T 细胞输注后的疗效、毒性和特征：所有患者输注新鲜 CAR-T 细胞后，6 例 B-ALL 患者（100%）完全缓解（CR），且第 90 天微小残留病（MRD）均为阴性；4 例 DLBCL 患者中 2 例（50%）达到 CR，1 例部分缓解（PR），1 例因疾病进展早期死亡。中位随访 15 个月时，10 名患者中有 8 名无疾病进展。毒性方面，80% 患者出现 1 级细胞因子释放综合征（CRS），2 例患者出现 2 级及以上 CRS，无患者发生免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），30% 患者出现 2 级及以上早期血液学毒性，仅 1 例患者出现 2 级及以上晚期血液学毒性。CAR-T 细胞在血液中的持续存在显示，外周血单核细胞中 CAR⁺T 细胞在第 18 天达到最大值，细胞剂量和恶性肿瘤类型对其增殖和持续存在无明显影响，持续存在的 CAR⁺细胞主要为 CD8⁺，且效应记忆和效应 T 细胞随时间增加，随后幼稚和中央记忆细胞逐渐增多。
5. 患者 CAR-T 细胞输注后的免疫重建情况：淋巴细胞亚群分析显示，输注后 14 - 28 天淋巴细胞开始恢复，自然杀伤（NK）细胞最早在 30 天内恢复正常水平且持续增加。B 细胞发育不全持续至第 90 天，10 名患者中有 9 名在 1 年后仍存在低丙种球蛋白血症。总 T 细胞亚群中，CD8⁺T 细胞比 CD4⁺T 细胞恢复更快，记忆亚群中效应记忆 T 细胞迅速扩张，随后中央记忆 T 细胞短暂增加，与先前研究相似。患者外周血细胞特征还显示，肝酶、乳酸脱氢酶、细胞因子短暂升高后逐渐恢复正常，血细胞计数也逐渐正常化。
6. HRU 和 CAR-T 细胞疗法的总成本：CAR-T 细胞疗法成本高昂，限制了其可及性。本研究从医院角度评估患者接受 CAR-T 细胞疗法的总成本，包括 HRU 和制造成本等。患者 CAR-T 细胞输注的中位住院时间为 20 天，HRU 评估涵盖输注前 7 天和输注后 60 天（中位）的门诊和住院就诊情况。主要成本驱动因素包括单采、医院护理、实验室检查、药物、咨询和输血等，中位成本为 12724 美元。先前研究显示产品制造成本为 35107 美元（不包括慢病毒载体成本），本研究中每位患者白血病和淋巴瘤的制造后 HRU / 临床管理平均成本为 47831 美元（不包括慢病毒载体成本）。

讨论

本 1 期研究成功建立并安全递送了 POC 制造的 CAR-T 细胞产品，与集中式制造相比具有诸多优势。制造的 CAR-T 细胞扩增倍数、转导效率和活力等指标与先前类似研究相当，转导效率与体内扩增无必然联系。起始材料中 T 细胞的状态影响 CAR-T 细胞治疗效果，B-ALL 患者起始时幼稚 T 细胞比例高于 DLBCL 患者，而最终 CAR-T 细胞产品中各亚型和疾病表型的中央记忆 T 细胞均增加，其具有更好的持久性和抗肿瘤活性。本研究采用的剂量递增策略确定 2×10⁶细胞 /kg 的剂量在安全性、耐受性和有效性方面较为合适。该 CAR-T 细胞疗法在预处理严重的患者中疗效显著，不良反应可控。同时，本研究全面评估了成本，POC 制造的 CAR-T 细胞疗法总成本仅为美国上市产品的十分之一。总之，POC 制造 CAR-T 细胞是可行、安全、耐受性良好且有效的，有望成为 r/r B 细胞恶性肿瘤的有效治疗选择，本研究为印度建立多个 POC 制造中心、提高 CAR-T 细胞疗法可及性奠定了基础，且该平台技术还可用于其他基因治疗。

方法

1. 研究审批：本研究（VELCART）获得印度多个机构审查委员会批准，包括机构审查委员会（CMC IRB No: 12469）、机构生物安全委员会（CMC IBSC No: 12469）和遗传操作审查委员会（RCGM No: BT/BS/17/159/2005-PID）等，临床试验在印度临床试验注册中心注册（CTRI/2022/10/046234），CAR-T 细胞在印度基督教医学院的良好生产规范（GMP）设施（ISO 7 级）中制造，所有实验和质量控制检测均在院内进行。
2. 研究细节和毒性监测：2023 年 3 月至 2023 年 11 月招募 6 例 r/r B-ALL 和 4 例 r/r DLBCL 患者，随访至 2024 年 12 月。研究采用 3 + 3 剂量递增策略，遵循赫尔辛基宣言标准，患者均签署书面知情同意书。依据相关指南评估疗效和毒性，B-ALL 患者根据骨髓 MRD 评估，DLBCL 患者通过正电子发射断层扫描 - 计算机断层扫描（PET CT）评估；CRS 和 ICANS 按美国移植和细胞治疗学会指南分级和治疗，免疫效应细胞相关血液毒性（ICAHT）按欧洲血液学协会 / 欧洲血液和骨髓移植学会建议分级，其他毒性按美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准（CTCAE v5）分级，B-ALL 患者达到 MRD 阴性后，由主治医生决定是否进行异基因干细胞移植。
3. 疗效监测：所有患者在淋巴细胞清除化疗前 15 - 20 天进行骨髓穿刺 / PET CT 检查。B-ALL 患者在 CAR-T 细胞输注后第 28 ± 2 天及 3、6、12 个月进行骨髓 MRD 检测，DLBCL 患者在输注后 3、6、12 个月进行 PET-CT 检查。MRD 通过多参数流式细胞术检测，使用 BD FACSLyric 仪器；CAR-T 细胞持久性通过流式细胞术在输注后多个时间点评估，使用 MACSQuant10 流式细胞仪。
4. 使用 CliniMACS Prodigy 系统制造 CAR-T 细胞：在 GMP 设施中使用 CliniMACS Prodigy 系统制造 CAR-T 细胞，采用 Miltenyi Biotec 的临床级试剂，按照制造商说明操作。富集 T 细胞后，取约 1×10⁸T 细胞进行培养，用 TransAct 激活，然后进行转导和培养扩增 9 天，每 3 天自动更换培养基，整个过程在无血清培养基中进行。
5. 慢病毒载体：使用第二代 CD19 CAR 慢病毒载体（LTG1563，Miltenyi Biotec），其包含基于单链可变片段 FMC63 的靶向结构域、41BB 共刺激结构域等，感染复数为 16 用于转导，该载体已在俄罗斯和美国有相关研究报道。
6. 细胞系：细胞系 NALM-6 和 K562 购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），定期检测支原体污染和进行短串联重复序列（STR）分析，所有体外实验在无血清的 TexMACS 培养基中进行。
7. 流式细胞术：对新鲜未固定细胞进行流式细胞术分析，使用不同抗体组合检测细胞亚群、转导效率、T 细胞耗竭和活化、T 细胞分化等指标，使用 MACSQuant 10 流式细胞仪（Miltenyi Biotech）和 DxFlex 流式细胞仪（Beckman Coulter）进行检测，数据用 Kaluza 分析软件 v2.1 和 Flow Jo v10.8.1 软件分析。
8. 细胞毒性试验：用 CellTrace Violet 染料标记靶细胞（CD19⁺ NALM6 细胞系）或非靶细胞（CD19^? K562 细胞系），与解冻并过夜休息的 CAR-T 细胞按不同比例在 96 孔板中共培养，过夜孵育后用 7AAD 染色，在 Navios 流式细胞仪（Beckman Coulter）上检测。
9. 抗原再刺激试验：将 0.5×10⁶CAR-T 细胞与等量靶细胞（CD19⁺细胞 - NALM6）共培养，每 48 小时用等量靶细胞重新刺激，通过流式细胞术检测 CAR-T 细胞增殖（使用 CAR 检测试剂）和肿瘤细胞增殖（使用 CD19 标记）。
10. 细胞因子分析：将约 1×10⁶CAR-T 细胞与等量靶细胞或非靶细胞共培养过夜，用 MACSplex 细胞因子 12 试剂盒（Miltenyi Biotec）检测上清液中细胞因子水平，包括 GM-CSF、IFN-α、IFN-γ 等，使用 MACSQuant 流式细胞仪检测。同时检测患者输注 CAR-T 细胞后外周血血浆中的细胞因子水平，样本按制造商说明稀释。
11. 前病毒检测：采用基于 TaqMan 的 qPCR 检测载体拷贝数，检测前病毒 GAG DNA 序列；使用病毒包膜序列（VSVG）检测复制型慢病毒。用 DNeasy 血液和组织试剂盒（Qiagen）提取 CAR-T 细胞 DNA，在 C1000 Thermal Cycler（Bio-Rad）上进行 qPCR。
12. 无菌检测：用基于 PCR 的通用支原体检测试剂盒（ATCC）检测支原体，用 Endosafe PTS 试剂盒（Charles River Laboratories）检测内毒素，微生物培养在印度基督教医学院认可的临床服务实验室进行。
13. 成本分析：从医疗服务提供者角度进行基于活动的成本分析，成本数据来自医院会计系统，评估 CAR-T 细胞输注前 7 天和输注后 60 天的住院时间和 HRU，包括住院、门诊和其他设施就诊情况，用 sankeyMATIC 工具绘制桑基图。
14. 统计学分析：使用 GraphPad Prism v8.0 软件进行数据分析，采用非配对双尾 Student’s t 检验比较两组均值，数据以均值 ± 标准误（SEM）表示，*、**、*** 分别表示 p 值小于 0.05、0.01 和 0.001 时有统计学意义。

数据可用性

研究数据在文章及补充信息中，其他数据可向相应作者索取。

致谢

本研究得到印度医学研究理事会（ICMR）资助，感谢 Miltenyi Biotech 提供慢病毒载体，Cytocare Technologies 在制造过程中的支持，以及众多人员在样本和数据采集、实验室检测、患者护理等方面的贡献。

作者贡献

H.K.P. 和 V.M. 构思并设计研究；H.K.P. 等多人参与研究、临床数据收集和审查；A.K.A. 进行流式细胞术聚类分析；A.B. 进行成本分析；P.D. 等提供关键指导和支持；H.K.P. 和 V.M. 撰写文章，所有作者阅读并批准最终稿件。

利益冲突

作者声明无利益冲突。