Systemic 4-1BB 刺激增强疟原虫感染期间的免疫记忆：机制与潜在应用

《Cell Reports》：Systemic 4-1BB stimulation augments extrafollicular memory B cell formation and recall responses during Plasmodium infection

这篇研究发现，在实验性疟疾小鼠模型中，外源性 4-1BB 刺激虽延迟效应生发中心（GC）反应，但能增强体液免疫记忆和抗感染能力。研究揭示其依赖于白细胞介素（IL）-9R 信号通路，为提升疟疾疫苗效力和免疫治疗提供了新方向。

　　

研究背景

疟疾严重威胁公共健康，2022 年约有 2.49 亿病例和 60.8 万人死亡，5 岁以下儿童受影响最大。现有抗疟疫苗如 RTS,S/AS01 和 R21 效果有限。清除疟原虫依赖 CD4 T 细胞辅助的 B 细胞活化，产生特异性抗体，而记忆 B 细胞（MBCs）在再次感染时可迅速分化为浆细胞（PCs），产生抗体。但自然获得的抗疟体液免疫记忆往往只能提供临床保护，无法实现无菌免疫。研究发现，共抑制受体表达会导致抗疟免疫反应低效，而外源性激活共刺激分子如 OX40 可改善疟原虫清除和保护作用。4-1BB（CD137）作为肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）成员，在增强 CD4 T 细胞功能上有独特作用，本研究旨在探究其在啮齿动物疟疾模型中的作用。

实验方法

1. 动物模型与感染：选用 6 - 8 周龄 C57BL/6 小鼠、4-1BB^?/?小鼠、Tbx21^?/?小鼠等，感染非致死性疟原虫 Plasmodium yoelii（Py）或致死性 P. berghei ANKA（PbA）。
2. 药物与抗体处理：给感染小鼠注射抗 4-1BB 抗体（3H3）、同型对照抗体（rIgG）、IFNγ 阻断抗体（XMG1.2）、IL-9 阻断抗体（9C1）等，部分小鼠用抗疟药青蒿素（artemether）处理。
3. 检测指标与技术：通过流式细胞术检测寄生虫血症、细胞亚群；用酶联免疫斑点试验（ELISpot）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体分泌细胞和抗体水平；采用单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、单细胞染色质可及性测序（scATAC-seq）、V (D) J 测序等技术分析细胞基因表达、染色质状态和 B 细胞受体（BCR）突变情况。

实验结果

1. 4-1BB 刺激对效应 GC 反应和寄生虫控制的影响：感染 Py 后，4-1BB 在脾 CD4 T 细胞上优先上调。4-1BB^?/?小鼠寄生虫负荷高于野生型（WT）小鼠。用 3H3 处理的 WT 小鼠感染进程延长，寄生虫总负荷增加 8 倍，GC 反应延迟，寄生虫特异性抗体积累缓慢，脾淋巴样结构破坏。但在缺乏 CD4 T 细胞 4-1BB 的小鼠中，3H3 驱动的寄生虫控制丧失现象得到逆转。
2. 4-1BB 刺激对再次感染保护作用的影响：感染 Py 后经 3H3 处理的小鼠，在 PbA 攻击后存活时间显著长于对照组，抗 MSP-1_-19抗体滴度增加倍数更高。用青蒿素缩短初次感染和初始寄生虫负荷后，3H3 处理的小鼠仍有增强的保护作用和更高的抗体滴度变化。在接种辐照血期 Py 寄生虫的小鼠中，3H3 处理结合 PbA 攻击也提供了更好的保护。
3. 4-1BB 刺激影响 MBCs 的数量和质量：3H3 处理的小鼠在 PbA 攻击后，骨髓（BM）中 MSP-1 特异性 PCs 数量显著增加，但总 MBCs 和抗原特异性 MBCs 数量较低。对 MBCs 亚群分析发现，3H3 处理的小鼠中，具有高增殖和分化能力的 CD73⁺CD80⁺等双阳性 MBCs 数量减少，但这些细胞在抗原刺激后增殖能力更强，且与 MSP-1 结合亲和力更高，功能更优越。
4. 4-1BB 刺激诱导 EF MBCs 的产生：scRNA-seq 分析显示，3H3 处理的小鼠中，总 MBCs 和 MSP-1 特异性 MBCs 主要聚类为具有额外滤泡（EF）起源基因特征的簇，而对照组小鼠的 MBCs 更类似于非典型 MBCs。3H3 处理的小鼠 MBCs 中，与 B 细胞激活、存活相关的基因表达增加，与 GC 来源 MBCs 相关的基因表达减少。
5. 4-1BB 刺激对 MBCs 转录谱的影响：3H3 处理的小鼠 MBCs 具有独特的转录谱，倾向于早期和可塑性阶段，分化远离终末非典型轨迹。功能分析表明，这些 MBCs 中与激活、增殖、抗原呈递和代谢相关的基因表达增加，同时对 IL-4 的细胞反应增强，促进 MBC 生成和激活。
6. 4-1BB 刺激诱导的保护作用的相关机制：3H3 处理诱导的保护作用依赖于 IFNγ 和 B 细胞内在的 T-BET:IL-9R 轴。CD4 T 细胞在 3H3 处理后分泌更高水平的 IFNγ，IFNγ 可促进 B 细胞中 T-BET 表达，T-BET 在效应阶段增强对再次攻击的保护。阻断 IFNγ 或敲除 Tbx21 基因，会消除 3H3 介导的保护作用。MSP-1 特异性 MBCs 在 IFNγ 阻断或 Tbx21^?/?小鼠中，IL-9R 表达显著降低。阻断 IL-9 或敲除 Il9r 基因，同样会减弱 3H3 处理小鼠的保护作用和 MBC 回忆反应。
7. 4-1BB 刺激对 MBCs 染色质可及性的影响：scATAC-seq 分析发现，3H3 处理的小鼠中，表达 IL-9R 的 MBCs 染色质可及性发生改变，与 PC 分化相关的基因位点（如 Il9r、Prdm1）和转录因子（TF）结合基序（如 XBP1、ATF3、MYC 等）的可及性增强，有利于 MBCs 迅速分化为 PCs。

研究讨论

本研究发现外源性 4-1BB 刺激在疟疾小鼠模型中，虽打乱效应 GC 反应、减少 MBCs 数量，但增强了 MBC 回忆反应和对再次感染的保护。这一现象与之前病毒感染模型研究有相似之处，但在体液免疫记忆反应方面有独特发现。研究揭示了 IFNγ:T-BET:IL-9R 轴在 MBCs 中的重要作用，为增强疟疾疫苗效力和免疫治疗提供了新靶点。然而，研究存在局限性，缺乏命运映射小鼠模型追踪 MBC 前体，无法精确确定其来源和位置。未来可进一步研究 IL-9 的来源细胞，以及开发 4-1BB 小分子激活剂，有望实现更有效的体液免疫激活和持久保护。