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本文揭示了混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）活性依赖于剪接调控的分子内相互作用。研究发现 MLKL 可变剪接产生抗坏死凋亡异构体，调控细胞死亡敏感性。还鉴定出关键激活机制，并开发出小分子抑制剂，为相关疾病治疗提供新思路，值得关注。
研究背景
坏死凋亡（Necroptosis）是一种受调控的细胞死亡形式，会在质膜透化后释放损伤相关分子模式（DAMPs），引发炎症反应，进而引导免疫应答。在多种疾病的发病机制中，如肾脏、心血管损伤、癌症、神经退行性疾病、自身炎症性疾病以及对细菌和病毒感染的免疫反应等，坏死凋亡都发挥着重要作用。
混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）是坏死凋亡通路中至关重要的下游效应蛋白，它包含 N 端四螺旋束结构域（4HB）和 C 端假激酶结构域（psK），二者由支架区域（Br）连接。正常情况下，psK 结构域抑制 MLKL 的死亡诱导能力，而受体相互作用蛋白激酶 3（RIPK3）对 psK 结构域的磷酸化作用，可激活 MLKL，促使其寡聚化并从细胞质转移到质膜，最终诱导细胞死亡。然而，psK 结构域调节 MLKL 激活的具体机制尚不明确。目前，针对坏死凋亡通路的抑制研究备受关注，MLKL 作为坏死凋亡的特异性效应蛋白，成为潜在的治疗靶点。但传统靶向 MLKL 的 ATP 结合位点开发抑制剂的策略，因与其他（假）激酶结构相似而受限。
研究结果
- 拮抗 MLKL 异构体决定坏死凋亡敏感性：小鼠 Mlkl 基因通过可变剪接产生三种转录变体，即 mMLKL1、mMLKL2 和 mMLKL3。研究发现，mMLKL2 可恢复 Mlkl?/? NIH-3T3 细胞对 TSZ（肿瘤坏死因子（TNF）、smac 模拟化合物（LCL-161）和泛半胱天冬酶抑制剂 z-VAD-FMK（zVAD）的混合物）诱导的坏死凋亡敏感性，而 mMLKL1 则使细胞完全抵抗细胞死亡，mMLKL3 具有内在活性。在多种细胞系和不同的坏死凋亡诱导途径中，均得到了类似的结果。通过构建缺失特定变体的突变小鼠发现，mMLKL1 可降低 mMLKL2 的磷酸化水平，进而抑制坏死凋亡。同时，炎症刺激（如干扰素 -γ（IFNγ）、脂多糖（LPS））可调节 MLKL 异构体的表达。在体内实验中，mMLKL2 促进炎症和坏死凋亡，而 mMLKL1 则发挥抑制作用，二者的相对表达水平决定了坏死凋亡的敏感性。
- mMLKL1 与 mMLKL2 和 RIPK3 相互作用并限制其激活：在永生的小鼠真皮成纤维细胞（MDFs）中，表达 mMLKL1 可降低坏死凋亡敏感性，并干扰 RIPK3 和 MLKL 的磷酸化。进一步研究发现，mMLKL1 和 mMLKL2 在基础和坏死凋亡条件下均能发生物理相互作用，且 mMLKL1 可抑制 mMLKL2 与 RIPK3 的相互作用，从而减少 RIPK3 的自磷酸化和 MLKL 的激活。此外，mMLKL1 可形成非磷酸化的寡聚体，分布于细胞质和细胞膜中，而 mMLKL2 在坏死凋亡时会发生磷酸化、寡聚化并转移到膜部分。通过单粒子全内反射荧光（TIRF）显微镜观察发现，mMLKL1 可减少 mMLKL2 在质膜上形成簇的细胞数量，表明其抑制了 mMLKL2 的激活。对 MLKL 异构体的泛素化研究发现，mMLKL1 呈多聚泛素化的涂抹模式，而 mMLKL2 则与激活相关的明确泛素化梯状条带有关，共表达 mMLKL1 可消除 mMLKL2 的这种泛素化模式。通过设计 mMLKL1 的突变体，证实了其蛋白 / 蛋白相互作用表面对抑制 mMLKL2 活性的重要性。
- mMLKL2 中 Hc 融入疏水凹槽对其坏死凋亡活性至关重要：利用分子动力学（MD）模拟对 mMLKL1 和 mMLKL2 的三维结构进行研究，发现 mMLKL1 的 Hc 因额外氨基酸可能部分展开，而 mMLKL2 的 Hc 可融入一个先前未被识别的疏水凹槽，该凹槽连接着 4HB、Br 和 psK 结构域。实验表明，改变 Hc 的结构（如插入丙氨酸、删除 C 末端或突变 Hc/groove 相互作用位点）会使 mMLKL2 失去活性，而稳定 Hc 与疏水凹槽的相互作用（如引入双半胱氨酸突变）则可使 mMLKL2 具有内在活性。对 mMLKL2 和 mMLKL1 的磷酸模拟物研究发现，只有 mMLKL2 的磷酸模拟物会发生涉及 Hc/groove 和 Br 的大规模结构重组，且具有活性，这表明 Hc/groove 相互作用对 mMLKL 的坏死凋亡诱导能力至关重要。
- Hc/groove 相互作用在人类 MLKL 中进化保守：人类 MLKL 存在多种异构体，其中 hMLKL0 是一种新发现的具有抗坏死凋亡功能的异构体，其功能类似于小鼠的 mMLKL1。结构模型显示，hMLKL1 的 Hc 可融入疏水凹槽，而 hMLKL0 的 Hc/groove 相互作用被破坏。通过对人类 MLKL 异构体进行突变实验，证实了 Hc/groove 相互作用在人类 MLKL 中的关键作用，与小鼠 MLKL 具有相似性。同时，通过氢氘交换质谱（HDX-MS）实验，验证了 Hc 插入疏水凹槽是 MLKL 激活的关键步骤。
- MLKL 的 Hc/groove 相互作用可被小分子选择性靶向抑制坏死凋亡：通过计算机筛选，获得了靶向人类和小鼠 MLKL 的 Hc/groove 的小分子抑制剂 MBA-h1 和 MBA-m1。在细胞实验中，MBA-h1 和 MBA-m1 可剂量依赖性地抑制人类和小鼠细胞的坏死凋亡，且不影响 RIPK1 和 RIPK3 的活性，主要通过干扰 MLKL 的寡聚化和膜转位来发挥作用。在体内实验中，MBA-m1 可显著改善由 MLKL 驱动的小鼠皮肤炎症和腹主动脉瘤疾病模型的症状，表明抑制 MLKL 活性可有效预防坏死凋亡驱动的疾病进展。
研究讨论
本研究揭示了 MLKL 结构对其功能的调控机制，即通过可变剪接产生具有不同功能的异构体，这些异构体相互拮抗，共同调节坏死凋亡敏感性。这一发现改变了以往对 MLKL 驱动的坏死凋亡的认识，表明其生物学效应是由具有不同生物学功能的异构体之间的相互作用决定的。同时，研究还发现了 MLKL 激活的核心机制 ——Hc 融入疏水凹槽，这一机制在小鼠和人类中保守，挑战了当前对 MLKL 自调节的认知，揭示了 Hc 作为调节 MLKL 活性的关键结构元件，其作用甚至优于磷酸化，为开发新的治疗策略提供了理论依据。此外，研究还发现了可靶向 MLKL 的药物结合位点，并开发出了具有概念验证的小分子抑制剂 MBA-h1 和 MBA-m1，尽管它们目前的效力不足以进入临床试验，但为进一步开发针对人类 MLKL 的治疗化合物提供了方向。
研究局限性
尽管本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。例如，Hc/groove 相互作用是发生在顺式还是反式尚不清楚；mMLKL1 更容易寡聚化、与膜相互作用以及缺乏磷酸化的分子决定因素也有待进一步研究；mMLKL1 干扰 mMLKL2 活性的具体机制，是通过将 mMLKL2 隔离到无坏死凋亡活性的复合物中，还是直接干扰坏死小体的超分子组装，目前也无法区分；此外，MLKL 激活如何促进 RIPK3 磷酸化和坏死小体活性的正反馈回路也尚未明确。最后，本研究中表征的 MLKL 抑制剂仍处于药物开发的早期阶段，需要进一步优化，并明确其潜在的脱靶结合位点。
研究展望
未来的研究可以聚焦于深入解析 MLKL 异构体调控坏死凋亡的详细分子机制，包括 Hc/groove 相互作用的具体方式、mMLKL1 和 mMLKL2 相互作用的精确模式等。同时，基于本研究发现的药物结合位点，通过优化现有小分子抑制剂或开发新的化合物，有望获得更有效的治疗坏死凋亡相关疾病的药物。此外，探究 MLKL 在不同生理和病理条件下的功能，以及与其他细胞死亡途径的相互关系，也将为理解细胞死亡调控网络提供新的视角。
