揭秘启动态多能细胞状态的调控架构：解锁干细胞奥秘的关键进展

为解析哺乳动物细胞状态的基因调控架构，研究人员开展小鼠上胚层干细胞（EpiSC）多能性调控网络架构的研究。他们鉴定并验证 132 个转录因子为关键调控因子，构建调控网络，发现 “社区交互” 模型。该研究为多能性机制提供见解，助力相关研究。

　　在生命科学的神秘领域中，干细胞的多能性一直是研究的焦点。多能性意味着细胞具有自我更新的能力，同时还能分化成所有胚胎细胞谱系，这一特性为再生医学带来了无限可能。然而，尽管科学家们在该领域投入了大量精力，哺乳动物细胞状态的基因调控架构仍如同迷雾，让人难以捉摸。以往对多能性网络架构的研究，大多聚焦于少数已知的调控因子，这些研究基于相对少量基因的分析，可能遗漏了关键特征，且无法全面揭示大规模网络拓扑结构。在此背景下，来自美国纽约哥伦比亚大学等机构的研究人员开展了一项重要研究，其成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解多能性调控机制带来了新的曙光。

为了深入探究启动态多能性的调控逻辑，研究人员采用了一种综合系统生物学方法。该方法整合了计算和实验技术，主要包括以下关键技术：首先，利用 ARACNe 算法，通过分析大量基因表达谱构建初始调控网络；其次，运用 VIPER 算法，从分化时间序列的基因表达谱中识别候选主调控因子（MR）；此外，借助 PLATE-seq 技术对候选 MR 进行功能验证，并构建实验衍生的调控网络；最后，使用 CRISPR 技术进行基因敲除实验，进一步验证 MR 的功能 。

研究结果如下：

1. 整体实验策略：研究人员设计了一个六步策略。第一步，通过对 EpiSC 进行多种小分子扰动处理，生成大量基因表达谱，为 ARACNe 算法提供输入，构建第一代 EpiSC 相互作用组。第二步，利用 VIPER 算法分析 EpiSC 沿多个谱系分化的基因表达时间序列，识别候选 MR。第三步，通过 RNAi 介导的沉默实验，验证候选 MR 调节多能转录状态的能力，确定了 132 个已确认的 MR。第四步，对 70 个此前未报道的 MR 进行 CRISPR 介导的敲除实验，通过细胞培养和畸胎瘤形成实验研究多能性缺陷。第五步，利用 RNAi 介导的 132 个已确认 MR 沉默后的 RNA - seq 谱，构建全面的、实验衍生的调控网络。第六步，通过模块性、层次结构和中心性分析，研究启动态多能性网络的架构。
2. 计算推断启动态多能性网络：研究人员通过组合 33 种小分子扰动和 5 种诱导分化条件，处理两种 EpiSC 细胞系，生成 276 种不同的基因表达谱。经 ARACNe 算法分析，得到包含 911,753 个 TF→靶标相互作用的 EpiSC 启动态多能性相互作用组。随后，利用 VIPER 算法分析 5 种不同分化协议处理后的 EpiSC 基因表达时间序列（共 144 个表达谱），并整合 VIPER 统计数据，确定了 300 个候选 MR，从中选择 172 个进行进一步分析。
3. 候选 MR 的实验验证：为系统确认 172 个候选 MR 在多能性控制中的功能，研究人员采用两种独立方法。一是检测候选 MR 沉默是否影响 Oct4 蛋白丰度，结果发现 117 个候选 MR 沉默后下调 Oct4 蛋白表达，15 个上调。二是利用 PLATE - seq 技术，通过比较候选 MR 沉默后的基因表达特征与 EpiSC 分化特征，确定了 132 个通过更保守测试（DS 分析）的 MR。
4. 启动态多能性 MR 的分化分析：研究人员对 70 个新确认的 MR 和 4 个已知 MR 进行 CRISPR 介导的基因敲除实验，生成 1150 个克隆 EpiSC 系和 128 个对照系。对候选敲除突变体和对照系进行形态学、自我更新和分化潜能分析，发现 18 个 MR 的敲除 / 敲低系在多种实验中表现出显著差异。进一步对 Cbl 和 Zc3h13 这两个 MR 进行深入研究，发现它们对维持畸胎瘤中的多能性至关重要。
5. 基于实验的启动态多能性网络：利用 PLATE - seq 基因表达谱，研究人员优化了 ARACNe 调控子，构建了 “实验策划” 的因果相互作用组（ECC - interactome）。通过评估沉默一个 MR 对另一个 MR 的 VIPER 推断活性的影响，得到了一个包含 1,273 个 MR→MR 相互作用的 EpiSC 调控 MR 网络。通过 Louvain 社区检测算法分析网络模块性，发现 74% 的确认 MR 被组织成四个不同的社区。
6. 启动态多能性的调控逻辑：根据 MR 与其他 MR 的相互作用，研究人员评估了它们在 EpiSC 多能性 MR 网络中的不同作用。通过计算 In - Degree、Out - Degree 和 “Regularized Out - Degree”（ROD）等指标，将 MR 分为 “Speakers”、“Listeners” 和 “Communicators” 三类，并确定了 4 个 “Mediator” MR。通过分析 MR 在五个谱系分化时间过程中的活性，发现四个社区的平均活性在所有分化特征中均显著降低，表明它们与特定谱系分化轨迹无关。通过通路富集分析，发现不同社区在调控启动态多能性中既有合作又有独特的作用。

研究结论和讨论部分指出，本研究构建的启动态多能性网络具有规模大、无偏性生成等特点，其分析方法具有创新性和可推广性。研究揭示了小鼠启动态多能性细胞中 “社区交互” 的调控模型，即启动态多能性由四个调控社区的平衡活动维持。虽然研究发现了一些关键的调控蛋白，如 Oct4、Otx2 等，但也存在一定局限性，如分析仅针对 1393 个注释为转录因子的基因、原始 EpiSC 相互作用组数据来源等问题。不过，该研究为阐明复杂细胞状态的调控逻辑提供了通用路线图，有助于进一步研究干细胞干性的分子机制，为再生医学的发展提供了有价值的资源，有望推动控制多能性动态的创新策略的发展，在再生医学领域具有重要的潜在应用价值。