Mutant huntingtin 通过解除对非经典聚 (A) 聚合酶 PAPD5 的抑制诱导神经元凋亡：亨廷顿病潜在治疗新方向

为探究亨廷顿病（HD）中 microRNA（miRNA）失调机制及寻找潜在治疗靶点，研究人员开展了关于突变亨廷顿蛋白（Mutant huntingtin）与非经典聚 (A) 聚合酶 PAPD5 关系的研究。结果发现 PAPD5 在 HD 中起关键作用，其抑制剂 BCH001 有治疗潜力，为 HD 治疗提供新方向。

　　亨廷顿病（Huntington’s disease，HD）是一种令人棘手的神经退行性疾病，患者会逐渐出现进行性的神经功能衰退和运动障碍，严重影响生活质量，目前仍缺乏有效的治疗手段。科学家们一直致力于揭开 HD 的发病机制，寻找潜在的治疗靶点，为患者带来新的希望。在这样的背景下，香港中文大学等机构的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，培养了人类神经母细胞瘤 SK-N-MC 细胞和诱导多能干细胞（iPSC），并进行转染实验以调控基因表达；对 iPSC 进行定向分化获得纹状体神经元。在动物实验方面，使用果蝇构建疾病模型。同时，运用免疫细胞化学（ICC）、荧光原位杂交（FISH）、蛋白质免疫印迹（western blotting）、实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）等技术检测相关蛋白、RNA 的表达及定位情况。此外，还利用了双荧光素酶报告基因检测、乳酸脱氢酶（LDH）检测等方法评估细胞活性和基因调控作用，研究样本包括患者的死后脑组织样本等。

研究结果如下：

1. Expanded CAG RNA 诱导 PAPD5 表达：研究人员通过 RNA 测序（RNA-seq）、RT-qPCR 和免疫印迹分析发现，表达非翻译性扩展 CAG 转录本（EGFP_CAG78）的 SK-N-MC 神经母细胞瘤细胞中，PAPD5 表达上调。在体外细胞实验和果蝇体内实验中，敲低 PAPD5 表达能抑制由扩展 CAG RNA 诱导的细胞死亡和神经退行性变，表明 PAPD5 在 CAG RNA 诱导的细胞毒性中起关键作用。
2. PAPD5 过表达通过 TAK1–MKK4–JNK 级联反应诱导细胞凋亡：研究发现 PAPD5 过表达可剂量依赖性地诱导 caspase-3 激活和细胞死亡，而催化失活的 PAPD5 突变体则无此作用，说明 PAPD5 的催化功能在诱导凋亡中至关重要。进一步研究表明，PAPD5 可激活 TAK1–MKK4–JNK 级联反应，使用 JNK 抑制剂和 TAK1 激酶抑制剂处理，能抑制 caspase-3 切割和细胞死亡，证实了该凋亡信号级联的存在。
3. CAG RNA 通过上调 PAPD5 表达改变细胞 miRNA 谱：研究人员检测发现，在表达突变 EGFP_CAG78的细胞中，有 186 种 miRNA 下调，敲低 PAPD5 表达后这些 miRNA 水平恢复正常，表明 PAPD5 在这些 miRNA 的失调中起关键作用。这些 PAPD5 调控的 miRNA 可调节多种细胞通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。
4. CAG RNA 下调靶向 TAB2 基因的 miRNA：预测 PAPD5 调控的 miRNA 靶基因发现，miR-7-5p、miR-22-5p 和 let-7b-5p 靶向 TAK1 结合蛋白 2（TAB2）。PAPD5 过表达会使 TAB2 表达增加，而催化失活的 PAPD5 突变体则无此效果。同时，PAPD5 可催化 miR-7-5p 的腺苷化，导致其水平降低，进而使 TAB2 表达异常上调。过表达 miR-7 可挽救突变 EGFP_CAG78 RNA 毒性细胞模型中的细胞死亡，并抑制相关信号通路的激活。
5. TAK1–MKK4–JNK 促凋亡信号在 HD 模型中失调：在果蝇和 SK-N-MC 细胞的 HD 模型中，研究人员发现敲低 dPAPD5 可减轻神经退行性变和运动缺陷，抑制相关信号通路的激活和细胞死亡。此外，抑制 JNK 或 TAK1 的活性，以及敲低 TAB2 的表达，都能挽救由突变亨廷顿蛋白（Htt）构建体诱导的细胞毒性，表明 PAPD5 在调节 HD 神经退行性变中起重要作用。
6. PAPD5 的药理抑制可挽救 HD 模型中的细胞死亡和视网膜变性：研究人员发现 BCH001 作为 PAPD5 的小分子抑制剂，可剂量依赖性地抑制 PAPD5 过表达或突变 Htt 构建体诱导的细胞死亡、TAK1/MKK4/JNK 磷酸化和 caspase-3 切割。在果蝇 HD 模型中，BCH001 还能抑制视网膜变性，提示其对 HD 具有潜在治疗益处。
7. YY1 负向调节 PAPD5 转录：研究人员在 PAPD5 启动子区域鉴定出一个保守的 YY1 转录调节因子结合位点。通过构建野生型和突变型 PAPD5 启动子报告基因进行荧光素酶检测，以及对 YY1 进行敲低实验发现，YY1 作为 PAPD5 的转录抑制因子，其功能在 HD 中失调，且该调节机制在果蝇中保守。
8. YY1 调节突变 CAG RNA 和 HD 细胞模型中 PAPD5 表达和 caspase-3 切割：在表达 EGFP_CAG78或突变 EGFP-Htt_1-550Q_89(CAG)的细胞中，操纵 YY1 水平可调节 PAPD5 表达和 caspase-3 切割，表明 YY1 在 CAG RNA 和 HD 细胞模型中调节 PAPD5 介导的 caspase-3 激活。
9. YY1 调节突变 CAG RNA 和 HD 果蝇模型中的视网膜变性：在果蝇模型中，敲低 dYY1 会增强视网膜变性，而过表达 dYY1 则可抑制这种变性。同时，过表达 dYY1 并敲低 dPAPD5 没有产生额外的抑制效果，表明 dYY1 和 dPAPD5 在 HD 发病机制中处于线性通路。
10. YY1 被招募到 HD 模型中的 CAG RNA foci 和 polyQ 蛋白聚集体中：研究发现，在 HD 果蝇和哺乳动物细胞模型中，YY1 蛋白水平降低，且 YY1 被招募到 CAG RNA foci 和 Htt–polyQ 蛋白聚集体中。ChIP-seq 分析显示，在 HD 细胞模型中，YY1 与 PAPD5 基因启动子的结合减少，导致 PAPD5 表达增加，从而激活凋亡信号。
11. CAG RNA foci 和 polyQ 蛋白聚集体都有助于 PAPD5 介导的凋亡信号和细胞死亡：通过使用不同的 Htt 构建体进行实验，研究人员发现 CAG RNA foci 和 polyQ 蛋白聚集体都能激活 PAPD5 介导的促凋亡信号，且突变 CAG RNA 在激活该信号和导致细胞死亡方面比聚集的 polyQ 蛋白作用更强。
12. YY1-PAPD5 凋亡通路在 HD 患者 iPSC 来源的纹状体神经元和死后脑样本中的作用：在 HD 患者 iPSC 来源的纹状体神经元中，YY1 蛋白与 CAG RNA foci 和 Htt-polyQ 蛋白聚集体共定位，PAPD5 蛋白水平显著增加，相关促凋亡信号通路被激活，使用 BCH001 处理可抑制该通路激活。在 HD 患者死后的纹状体组织中，也检测到 PAPD5 表达增加、miR-7-5p 表达降低和 TAB2 水平升高，且该通路在纹状体中的激活程度比小脑更明显，这与 HD 中组织特异性神经退行性变的模式一致。

研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了 HD 发病机制中 PAPD5 介导的 miRNA 失调、YY1 功能障碍以及 TAK1–MKK4–JNK 促凋亡信号通路的激活。PAPD5 通过催化 miRNA 的腺苷化，直接或间接导致多种 miRNA 水平下降，进而影响相关细胞通路。YY1 被招募到 CAG RNA foci 和 polyQ 蛋白聚集体中，使其对 PAPD5 转录的抑制作用减弱，导致 PAPD5 表达上调。此外，研究还发现 BCH001 作为 PAPD5 的抑制剂，在细胞和果蝇 HD 模型中表现出良好的治疗效果，为 HD 的治疗提供了新的潜在方向。这一研究成果不仅加深了人们对 HD 发病机制的理解，更为开发新的治疗策略提供了重要的理论依据，有望为 HD 患者带来新的希望。