微生物战争给我们带来了CRISPR，接下来会有什么重大突破？

《Nature》：Microbial warfare brought us CRISPR. What big breakthroughs could be next?

基因编辑和许多其他有用的生物技术工具来自对细菌抵抗病毒入侵者的研究。但科学家们才刚刚开始揭开这场古老军备竞赛的秘密。细菌免疫系统成分可以用来改变其他生物的基因，如酵母。

　　

在世界各地 —— 在海洋中、土壤里、你的身体内 —— 一场无形的战斗正激烈地进行着。地球上大约有1030数量级的庞大细菌群体，正面临着一支更为庞大的病毒大军的不断攻击，这些病毒被称为噬菌体。细菌拥有多种防御手段可供使用：它们会切碎病毒成分，不给入侵者用于复制的关键物质，甚至关闭自身的生物系统以阻止感染，牺牲自己来保护附近的同类。反过来，病毒也会进化出反防御机制，从而导致一场不断升级的军备竞赛。

尽管微生物学家才刚刚开始了解这场永恒较量的程度，但微生物的免疫机制已经启发了一些技术，这些技术彻底改变了生物学领域。限制性内切酶（一种能在特定位点切割 DNA 的细菌蛋白）的发现，在 20 世纪 70 年代催生了分子生物学领域，使得从转基因生物的开发到 DNA 法医鉴定等一切成为可能。CRISPR-Cas 系统是一种能够识别并切割病毒基因组中特定序列的细菌防御系统，它赋予了科学家以极高的精度删除或编辑基因的能力。基于 CRISPR 的基因编辑技术在 21 世纪 10 年代早期得以开发，吸引了数十亿美元的投资，并为其关键发现者赢得了 2020 年诺贝尔化学奖。

CRISPR-Cas 系统和其他突破性进展激发了人们对微生物防御系统的浓厚兴趣，并带来了诸多发现。得益于计算生物学和基因组测序技术的进步，科学家们已经确定了一系列细菌以及地球上另一种原核生物形式 —— 古菌 —— 在与病毒持续的生存斗争中所使用的免疫机制（见《微生物免疫的多个方面》）。

“我可以大胆地说，细菌和古菌使用了一切你能想象到的防御手段 —— 甚至还有一些你想象不到的，” 马里兰州贝塞斯达国家医学图书馆的进化生物学家尤金・库宁（Eugene Koonin）说。

这些发现已经带来了基因编辑和其他实验室技术的改进。而且这些防御机制 —— 其中一些在人类免疫系统中有类似物 —— 很可能会催生出新的治疗方法，尤其是在噬菌体疗法领域。噬菌体疗法能够杀死致病细菌但对人类无害，同时也会对抗生素领域产生影响。尽管目前似乎没有任何一项技术有望取代 CRISPR-Cas 系统，使其不再是本世纪最具变革性的生物学发现之一，但人们对此的兴奋之情显而易见。

“要比 CRISPR 做得更好是一项非常艰巨的任务，” 库宁说，但 “有一些这样的系统有着非常重要的应用”。

强大的防御
尽管细菌、古菌以及它们的噬菌体已经相互竞争了数十亿年，但直到大约过去十年左右，微生物学家才开始注意到这些各种各样的防御系统。在一定程度上，这是因为此前没有简单的方法来寻找它们，以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所的微生物学家罗特姆・索雷克（Rotem Sorek）说。

这种情况在 2011 年发生了改变，当时进化生物学家库宁、基拉・马卡罗娃（Kira Makarova）及其同事指出，微生物基因组中的免疫基因往往会聚集在 “防御岛” 中。这一发现意味着科学家们可以利用已知的防御基因来在其附近寻找可能的相关基因。

很快，候选基因便不断涌现。在随后的几年里，索雷克的团队和其他研究小组报告了数百个潜在的防御基因。到目前为止，大多数研究都集中在细菌上，因为科学家们有充足的工具来对细菌基因进行研究。

为了验证一个防御系统，科学家们可以选择一个候选基因，将其插入实验室标准菌株的细菌中，然后测试这些基因是否能让微生物抵御之前无法抵御的噬菌体。莫斯科分子与细胞生物学中心的微生物免疫学家阿尔乔姆・伊萨耶夫（Artem Isaev）说，新的发现层出不穷。“现在，我们的期刊俱乐部每周要讨论五篇论文，但我们都没有时间讨论所有内容。”

研究已经揭示了一些令人惊讶的免疫机制，比如生物化学家菲利普・克兰祖施（Philip Kranzusch）在加利福尼亚大学伯克利分校詹妮弗・杜德纳（Jennifer Doudna）实验室做博士后研究员时遇到的情况。克兰祖施并不是微生物学家，他接受的是人类病毒学方面的培训。在 21 世纪 10 年代早期，他对一种名为 cGAS 的人类免疫蛋白很感兴趣。它能检测到外来 DNA，并产生一种信号分子，启动免疫系统中被称为干扰素反应的部分。

细菌中含有能产生类似信号分子的酶，所以克兰祖施想知道研究这些酶是否能为理解 cGAS 的功能提供线索。值得注意的是，细菌中的这些蛋白质与 cGAS 的结构非常相似。“我记得当时冲进詹妮弗的办公室，” 克兰祖施回忆道，“在人类细胞中发现的同样的机制，在细菌中也存在。”

克兰祖施在位于马萨诸塞州波士顿的哈佛医学院自己的实验室里继续研究这个系统。索雷克也在研究细菌中与 cGAS 相对应的系统，称为 CBASS。他们的团队表明，CBASS 是一种真正的微生物防御系统，它甚至使用与人类免疫系统中相同的信号分子受体，即 STING。

克兰祖施和索雷克还发现了真核生物中被称为 Gasdermin 的免疫蛋白在细菌中的对应物，它们会在细胞膜上形成孔洞，从而杀死被感染的细胞并阻止病毒复制。当时在索雷克实验室做博士后的微生物学家奥德・伯恩海姆（Aude Bernheim）及其同事描述了真核生物中 viperin 蛋白在原核生物中的版本：这些蛋白会产生一些分子，阻止病毒基因转录成 RNA。索雷克的团队还描述了一种名为 Thoeris 的微生物免疫机制，它与植物的防御机制有很多相似之处。

“从进化的角度来看，这非常出乎意料，” 现就职于巴黎巴斯德研究所的伯恩海姆说。科学家们曾推测，面对持续的病毒攻击，免疫系统会迅速进化，从而导致原核生物和真核生物的防御机制之间出现巨大差异。然而，至少在某些情况下，一种在原核生物和真核生物的共同祖先中进化出来的系统，在数十亿年的进化过程中得以保留，在微生物与人类或植物中形成了类似的生物学机制。

开发工具
如今，生物技术专家们正在将这些古老的创新成果转化为实验室或临床工具。

在基础层面上，它们可以保护有价值的微生物培养物，在杜德纳实验室工作的研究生欧文・塔克（Owen Tuck）说，他正在研究一种名为 Hachiman 的能够分解 DNA 的防御系统。例如，如果一个生物反应器被噬菌体感染，科学家们可以激活细菌中的防御机制来消灭入侵者，塔克说。

研究人员也在开发定制工具。以 Argonaute 系统为例，这是一种最初在真核生物中发现的免疫反应 —— 先是在植物中，然后在动物中发现。它利用小 RNA 引导序列来靶向其他 RNA，比如病毒 RNA，以将其摧毁。荷兰瓦赫宁根大学及研究中心的生物化学家达恩・斯瓦茨（Daan Swarts）说，在微生物中，Argonaute 系统的工作方式更加多样化。他推测，Argonaute 传感器可能会检测到松散的 DNA 末端，或者过量的环状 DNA 分子。在受到感染时，与 Argonaute 相关的机制可能会破坏病原体基因，或者耗尽细胞中关键的代谢物，如 NAD + 和 NADP+，这些代谢物参与能量生成和其他过程。

研究人员已经利用微生物中的 Argonaute 蛋白来编辑细菌基因组，并在试管中切割精确的 DNA 序列。在寻找特定稀有序列的实验中，科学家们也使用 Argonaute 蛋白来去除常见但不需要的序列，这样稀有序列就更容易被检测到。斯瓦茨和他的团队还设计了诊断方法来识别感兴趣的序列。为此，他们对消耗 NAD+/NADP + 的系统（称为 SPARTA）进行了改造，创建了一种测试方法，一旦捕获到目标序列，测试就会变色或发出荧光。“基本上，任何类型的序列都可以用这些 Argonaute 蛋白来检测，” 斯瓦茨说，“我们目前还没有遇到任何限制。”

许多这些任务都可以由 CRISPR-Cas 系统来完成，但 Argonaute 蛋白提供了一些不同的特性。这两个系统都需要一个引导 RNA 来寻找目标序列，而且 Cas 酶还需要一段额外的序列，称为前间区序列邻近基序（PAM），它能帮助 Cas 酶结合并解开 DNA 双螺旋。Argonaute 系统在没有 PAM 的情况下也能工作，而且引导 RNA 序列可以更短，这使得该系统更容易制造。此外，斯瓦茨指出，为 Argonaute 蛋白提交专利申请要比在竞争激烈的 CRISPR-Cas 领域为相关想法获得专利更容易。

位于马萨诸塞州剑桥市的麻省理工学院和哈佛大学博德研究所的分子生物学家张锋发现了另一种高效的类似 CRISPR 的系统。他和他的同事们寻找与 CRISPR-Cas 系统在基因序列和蛋白质结构上相似的分子，发现了一种他们称之为 TIGR-Tas（串联间隔引导 RNA-TIGR 相关蛋白）的 DNA 结合系统。和 CRISPR 一样，它是一个由两部分组成的系统，能够检测特定的 DNA 序列，并且可以被编程在所需的位置进行切割。但是 TIGR-Tas 系统不需要 PAM，而且其组成部分在物理上比 CRISPR 系统的更小，这在基因治疗等应用中可能很有用，因为在基因治疗中，只能向组织输送有限数量的分子载体。

另一个有望带来创新的细菌防御系统涉及一种被称为逆转录子（retron）的遗传元件。它们是在 20 世纪 80 年代被发现的，当时科学家们在土壤细菌黄色黏球菌（Myxococcus xanthus）的样本中发现了数百个短单链 DNA 的拷贝。他们确定这些单链 DNA 是由一种逆转录酶产生的 —— 这种酶能以 RNA 为模板合成 DNA—— 而这种类型的系统就被称为逆转录子。21 世纪 10 年代早期，在格拉德斯通研究所和加利福尼亚大学旧金山分校工作的生物工程师赛斯・希普曼（Seth Shipman）在科学文献中看到了逆转录子，当时他正在寻找一种在细胞中制造特定 DNA 序列的方法。“它们简直就是完美的工具，” 他说。