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本文利用单分子力谱（SMFS）和核磁共振光谱（NMR）技术，研究免疫调节蛋白 Roquin 的 ROQ 结构域与 Ox40 mRNA 的 3’非翻译区（UTR）的相互作用。发现 Roquin 通过 A、B 两个位点对 RNA 茎环结构稳定性有相反作用，为理解 mRNA 衰变调控提供新视角。
研究背景
RNA 顺式元件在细胞关键过程调控中意义重大，其与反式作用蛋白的特异性结合影响细胞功能。免疫调节蛋白 Roquin 可识别 RNA 发夹结构，介导 mRNA 衰变，它含有 A、B 两个 RNA 结合位点，但其与靶 RNA 的协同作用机制尚不明确。研究 RNA - 蛋白复合物结构和动力学颇具挑战，单一技术难以全面解析，本研究整合 NMR 和单分子力谱（SMFS）技术，对 Roquin 与 Ox40 mRNA 的 3’非翻译区（UTR）的相互作用展开研究。
实验方法
- 蛋白质表达与纯化：在大肠杆菌 BL21 中表达鼠 Roquin - 1 的 ROQ 结构域，包括 coreROQ 和 extROQ，使用同位素标记的 M9 培养基，经 IMAC、TEV 蛋白酶切割、透析和 SEC 等步骤纯化，通过 SDS - PAGE 和 NMR 光谱检测纯度和结构完整性。
- RNA 体外转录与纯化：通过 PCR 和 Gibson 组装生成 RNA 转录模板，转录后经沉淀、尿素聚丙烯酰胺凝胶纯化，缓冲液交换后储存。用于 OT 实验的 RNA 带有 5’和 3’ 末端，以便与 DNA 手柄退火。
- NMR 光谱：在 Bruker Avance III 光谱仪上进行实验，使用 Topspin 和 NMRFAM - Sparky 软件分析。记录 HNN - COSY 实验检测碱基对氢键，以及 1H,15N - HSQC 光谱研究蛋白与 RNA 的相互作用。
- OT 测量：制备生物素和地高辛功能化的 DNA 手柄，与 RNA 和适配体组装成哑铃状结构，连接到微珠上进行实验。实验使用特定的微流控芯片，在不同缓冲液条件下测量，控制温度和陷阱刚度，对数据进行降采样分析。
- 其他方法：通过速率测定获取 Roquin 与 ADE 的结合和解离速率；利用圆二色谱（CD）光谱监测 RNA 的二级结构变化；进行电泳迁移率变动分析（EMSA）研究蛋白与 RNA 的结合亲和力；通过羟基自由基探测（OH?probing）了解 RNA 的溶剂可及性和构象变化。
实验结果
- OT 实验捕获 Ox40 3’UTR 的结构和折叠中间体：研究不同复杂度的 Ox40 3’UTR 构建体，发现 CDE 呈快速两态折叠 / 解折叠转变，ADE 有两个明显转变，组合构建体和全长构建体展现出各自元件的特征。OT 实验揭示了元件间的结构独立性，以及全长 3’UTR 折叠 / 解折叠网络的形成机制。
- Ox40 ADE 存在多种折叠中间体：NMR 数据支持 ADE 的二级结构，OT 实验进一步发现 ADE 在折叠过程中有多个中间态，包括三个主要的中间态（I1、I2、I3）和一个错折叠态（M），其折叠平衡倾向于完整茎环结构，且存在更多瞬态中间体。
- Roquin 稳定 Ox40 ADE 的顶端茎环结构：在近生理缓冲条件下，OT 实验表明 Roquin 的 coreROQ 和 extROQ 均能稳定 ADE 的 I3 中间体，即顶端茎环结构。extROQ 的稳定作用更强，这主要源于其降低了解离速率，且两者对折叠 I3 的亲和力远高于未折叠 RNA。
- Roquin 促进 ADE 下部茎区的不稳定：CD 熔解曲线显示 Roquin 降低了 ADE 的熔解温度，NMR 和 OH?probing 实验表明 Roquin 稳定了顶端茎环及相邻结构，却使下部茎区更易暴露于溶剂中，呈现出对不同茎区稳定性的相反作用。
- Roquin 的 B 位点使 RNA 结构平衡向部分开放构象转变：在 extROQ 存在下，OT 实验发现 Roquin 降低了 ADE 中 I1 的稳定性，主要通过减缓其重折叠速率，表明 Roquin 对 ADE 结构有双重影响：A 位点稳定顶端茎环，B 位点使中央茎不稳定。
- Roquin 的 B 位点结合单链 RNA（ssRNA）：EMSA 和 NMR 实验表明 extROQ 可与单链 ADE 片段及双链 RNA 结合，而 coreROQ 结合较弱。构建镜像 ADE 实验发现，其与 Roquin 的结合能力降低，说明序列和几何结构影响 RNP 形成。
讨论
- OT 和 NMR 结合解析 RNA/RNP 折叠景观：OT 和 NMR 结合能全面描述中等大小 RNA 元件的折叠景观、Roquin 的 RNA 结合结构域与 RNA 区域的相互作用，以及 Roquin 对 RNA 折叠景观的调控。OT 提供单核苷酸分辨率和动力学信息，NMR 辅助解释折叠事件，两者相互补充，有助于理解 RNA 折叠中间体的功能和 RNA - 蛋白相互作用的能量景观。
- Roquin 对 RNA 结构的双模式调节：Roquin 的 B 位点与 ssRNA 结合，促进中央茎的开放，降低双链稳定性，扩大了其 RNA 靶标范围。这一机制可能在 RNA 顺式元件稳定性调节和转录后调控中发挥重要作用，影响 mRNA 的命运，如招募核酸酶降解 mRNA。未来研究需进一步明确 Roquin 与其他蛋白的相互作用、潜在的协同或二聚化机制，以及其在基因调控中的整体作用。
