贵州冬眠蝙蝠肠道菌群探秘：结构、功能与潜在影响

本文通过 16S rRNA 高通量测序和培养组学技术，对贵州冬眠蝙蝠肠道菌群进行研究。发现不同蝙蝠（Pipistrellus、Rhinolophus、Myotis）肠道菌群组成和多样性差异显著，还涉及潜在新物种。该研究对理解蝙蝠生态、微生物功能及公共卫生意义重大。

　　### 研究背景
蝙蝠是全球哺乳动物中种类繁多的群体，在生态系统平衡中扮演关键角色。位于中国西南部的贵州省，独特的喀斯特地貌为蝙蝠提供了特殊的生存环境。肠道微生物群对蝙蝠的健康、生理功能以及生态系统功能、病原体传播和人类健康都有重要影响。在冬眠期间，蝙蝠代谢活动大幅降低，肠道微生物群的组成和功能也随之改变。了解这些变化，对于揭示蝙蝠的生态适应机制和微生物生态学原理至关重要。同时，不同蝙蝠物种的肠道微生物群物种多样性可能存在差异。

高通量测序技术，尤其是 16S rRNA 基因测序，已成为研究微生物群落组成和功能的重要工具，相比传统培养技术，能更高效、全面地解析微生物群落结构。不过，基于培养的方法在分离致病微生物方面也不可或缺。目前，针对中国西南地区冬眠蝙蝠肠道微生物群的系统研究较少。本研究旨在运用 16S 高通量测序结合培养组学，系统分析该地区冬眠蝙蝠肠道微生物的组成和功能特征，填补研究空白，为公共卫生领域提供参考。

材料与方法

1. 样本采集与制备：在贵州省黔东南州黎平县的两个洞穴中，捕获了 24 只冬眠蝙蝠，包括 9 只伏翼属（Pipistrellus，PB）、9 只菊头蝠属（Rhinolophus，RB）和 6 只鼠耳蝠属（Myotis，MB）蝙蝠。捕获后，在无菌条件下将蝙蝠带回实验室处理，取约 200mg 直肠组织（含粪便）放入 2mL 无菌冻存管，加入脑心浸液（BHI）培养基并标记，随后在无菌环境中匀浆。选取 18 个样本用于高通量测序和分析，分为 PB（CD1 - 6）、RB（CD7 - 12）、MB（CD13 - 18）三组，每组 6 个样本；剩余 6 个样本（3 个 PB 和 3 个 RB）用于培养组学研究。
2. DNA 提取和 16S 扩增子测序：采用细菌 DNA 提取试剂盒提取 18 只蝙蝠直肠组织（含粪便）的 DNA。由深圳伟科盟科技集团进行 16S rRNA 基因高通量测序，使用 341F（5′ - CCTAYGGGRBGCASCAG - 3′）和 806R（5′ - GGACTACNNGGGTATCTAAT - 3′）引物扩增 16S rRNA 基因的 V3 - V4 区域，并添加条形码。按照 NEB Next Ultra DNA 文库制备试剂盒（Illumina，美国）的说明构建测序文库，添加索引代码，用 Agilent 5400 评估文库质量，最后在 Illumina 平台测序，生成 250bp 双端读数。
3. 测序数据处理：原始序列数据经 Trimmomatic（0.35 版）滑动窗口法处理，质量分数低于 20 的序列被修剪，长度短于 50bp 的序列被丢弃。利用 Flash 软件合并剩余的双端原始数据，得到完整双端序列。通过 Qiime2（2022.2 版）中的 DADA2 插件（1.22.0 版）对原始序列进行质量控制、去噪、合并和去除嵌合体，生成标准化的操作分类单元（OTU）。
4. 培养组学和物种鉴定：对 PB 和 RB 的肠道样本进行培养组学研究。设置四种培养基：哥伦比亚血琼脂、添加 8% 羊血的 BHI 培养基、添加 8% 瘤胃液的 BHI 培养基和 BHI 琼脂平板。在 28°C 和 37°C 的需氧、微需氧和厌氧条件下培养。培养 48 - 72 小时后，挑取菌落并传代培养三代进行分离纯化。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI - TOF MS，Autof MS 1000，中国安图生物）鉴定单纯化菌落，得分超过 9 表示物种水平的可信度。对于得分低于 9 的菌株，提取 DNA，用 27F（5′ - AGTTTGATCMTGGCTCAG - 3′）和 1492R（5′ - AGTTTGATCMTGGCTCAG - 3′）引物扩增 16S rRNA 基因，在北京天一辉远生物技术有限公司测序，将所得序列与 NCBI 数据库的 BLAST 比对确认菌株身份。新物种判定标准为 16S rRNA 基因序列相似性大于 98.7% 为同一物种，低于 98.7% 则可能是新物种。
5. 数据分析：将 OTU 分为 PB、MB 和 RB 三组，每组 6 个样本。将 OTU 与 Greengenes2 数据库（2022.10 版）比对进行分类注释，展示每组中丰度最高的前 20 个物种，其他低丰度物种归为 “Other”。用 LEfSe 方法基于相对丰度表分析组间差异丰度，以线性判别分析（LDA）得分表示。利用 Qiime2 多样性插件进行 α 多样性和 β 多样性分析。α 多样性通过 Chao1、Faith 系统发育多样性（Faith - pd）、观测特征数、香农（Shannon）和辛普森（Simpson）指数评估，组间差异用 Wilcoxon 检验。β 多样性分析包括非度量多维缩放（NMDS）、主坐标分析（PCoA）和主成分分析（PCA），基于 OTU 丰度信息计算 Bray - Curtis、加权 UniFrac 和未加权 UniFrac 距离，比较微生物群落结构差异。选取每个注释属中丰度最高的 OTU 构建前 50 个属的系统发育树。基于 PICRUSt2 原理，根据 KEGG 和 MetaCyc 数据库中已测序微生物基因组的序列预测微生物群落功能，KEGG 数据库功能注释分为三个层次（L1、L2、L3）。所有数据分析在 Wekemo Bioincloud 平台完成。

结果

1. 物种注释和丰富度：注释结果显示共有细菌和古菌两个微生物界，鉴定出 28 个门、50 个纲、138 个目、202 个科、382 个属和 464 个物种。在门水平上，RB 组中变形菌门（Proteobacteria）占比最高（80.99%），MB 组主要为变形菌门（60.37%）和厚壁菌门_D（Firmicutes_D，34.02%），PB 组则以厚壁菌门_A（Firmicutes_A，65.20%）为主。属水平上，RB 组中哈夫尼菌属（Hafnia，40.44%）、耶尔森菌属（Yersinia，12.91%）等较高；MB 组中变形杆菌属（Proteus，16.50%）、乳球菌属_A（Lactococcus_A，16.35%）等较多；PB 组中副梭菌属（Paraclostridium，20.91%）、梭菌属_T（Clostridium_T，18.10%）等占比较大。物种水平上，RB 组中粪肠球菌（Enterococcus faecalis，5.97%）等较高；MB 组中黏液考斯尼菌（Cosenzaea myxofaciens，16.50%）等较多；PB 组中解苯甲副梭菌（Paraclostridium benzoelyticum，20.91%）等占比较大。此外，各分组中未分类的分类单元占比都较高，RB 组在物种水平上未分类比例达 83.81%。Venn 图显示 MB 组 OTU 数量最多（729 个），RB 组（266 个）次之，PB 组最少（126 个），三组共有的 OTU 仅 22 个。聚类分析表明，不同分类水平下，三组的聚类热点不同，MB 组物种丰富度较高，RB 组最低。
2. Alpha 多样性分析：α 多样性分析结果显示，MB 组的物种丰富度高于 RB 组，RB 组高于 PB 组，Chao1、Faith - pd 和观测特征数指标差异具有统计学意义，而 Shannon 和 Simpson 指数差异不显著。
3. Beta 多样性分析：β 多样性分析表明，三组间存在显著差异。NMDS 分析显示 RB 组细菌群落更分散，PB 和 MB 组相似性较高。二维 PCoA 显示 RB 和 PB 组距离较大，且群落更分散，MB 组更集中。PCA 显示 RB 和 PB 组聚类在一起，MB 组明显分离，第一主成分（PC1）是影响细菌多样性的主要因素，贡献率为 41.19%。基于 OTU 丰度信息计算的 Bray - Curtis、加权 UniFrac 和未加权 UniFrac 距离表明，不同蝙蝠个体间肠道微生物群多样性存在差异，不同物种间也有相似性。
4. 物种进化分析：选取各注释属中丰度最高的 OTU 构建前 50 个属的系统发育树，这些属分属 7 个不同的门。其中变形菌门有 21 个属，厚壁菌门_D 有 10 个属，放线菌门（Actinobacteriota）有 10 个属，其余分布在其他门。MB 组在放线菌门和变形菌门的丰富度热点最高，在疣微菌门（Verrucomicrobiota）、蓝细菌门（Cyanobacteria）和芽单胞菌门（Gemmatimonadota）的热点也更明显；RB 组主要集中在变形菌门和厚壁菌门_A；PB 组则主要在厚壁菌门_A 和厚壁菌门_D。
5. 基因功能预测：利用 KEGG 和 MetaCyc 数据库对三种蝙蝠肠道微生物群进行功能预测，KEGG 通路共 6 类，代谢通路占比最高，人类疾病通路在 RB 组占 6.30%，MB 组占 5.86%，PB 组占 6.34%。KEGG 通路 L2 层包含碳水化合物代谢、氨基酸代谢等多种类别，L3 层有 D - 丙氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成等。MetaCyc 数据库预测的通路中，部分在 PB 组占比较高。PCA 分析显示，在 KEGG 通路 L1 层，三组差异不明显；在 L2 和 L3 层，RB 和 PB 组基因功能相似且集中，MB 组功能范围更广，MetaCyc 通路分析结果也显示 MB 组基因功能特征独特。
6. 培养组学结果：PB 和 RB 组的培养结果显示，从 6 个肠道样本中捕获了 221 个疑似菌落，其中 124 个经 MALDI - TOF MS 鉴定得分大于 9。97 株菌株的 16S rRNA 基因序列比对显示，96 株与 NCBI 数据库中相似性超 99%，有 1 株与 Clostridium paraputrificum strain JCM 1293 相似性仅 98.18%，经全基因组测序、ANI 和 dDDH 分析确认是梭菌属新物种。共培养出 45 种细菌，PB 组 23 种，RB 组 27 种，两组共有 5 种。培养出的细菌包括粪肠球菌、蜂房哈夫尼菌等，还发现了对人类可能有潜在健康风险的细菌，如成都肠杆菌（Enterobacter chengduensis）、华西杆菌（Huaxiibacter chinensis）等。哥伦比亚血琼脂平板分离出的细菌最多，占 34.39%；28°C 和 37°C 培养的细菌数量相近；微需氧条件下培养成功率最高，为 36.65%。RB 组样本间细菌种类差异较大，PB 组差异较小。

讨论

本研究综合运用高通量测序和培养组学方法，全面研究了贵州冬眠蝙蝠的肠道微生物群。蝙蝠作为病原体载体和生态平衡维护者，了解其肠道微生物群对宿主健康、代谢功能和人畜共患病传播研究意义重大。

研究发现，三种蝙蝠肠道微生物群组成差异明显。门水平上，变形菌门虽在三组中均占优势，但相对丰度不同。RB 组变形菌门占比最高，PB 组厚壁菌门_A 和厚壁菌门_D 更丰富，可能与饮食或肠道生理适应性有关。属水平上，RB 组哈夫尼菌属和耶尔森菌属含量高，反映其饮食偏好或环境暴露，耶尔森菌属部分菌种对人类健康有威胁。三组共有的 OTU 表明存在核心微生物群，可能维持基本肠道功能，而独特 OTU 则与组特异性适应有关。MB 组 OTU 数量最多，说明其微生物生态系统更具多样性和弹性，可能与饮食或环境因素有关。

α 多样性分析中，MB 组物种丰富度高于 RB 和 PB 组，反映出饮食、栖息地等生态因素对肠道微生物群组成的影响。β 多样性分析显示，RB 组细菌群落分散，MB 和 PB 组更相似，PCA 结果表明 MB 组微生物群落与其他两组差异显著，可能受生态因素或宿主特征影响。

优势 OTU 分析显示，MB 组在放线菌门和变形菌门的丰富度热点突出，在疣微菌门、蓝细菌门和芽单胞菌门的独特热点值得进一步研究。KEGG 通路分析表明，肠道微生物群功能以代谢通路为主，同时人类疾病通路占一定比例，反映其对宿主健康的潜在影响。不同层次的代谢通路显示蝙蝠能适应多种饮食来源，特殊代谢途径影响蛋白质合成和神经递质生成。

培养组学研究发现，PB 和 RB 组细菌种类差异明显，受饮食、栖息地和行为等因素影响。首次在蝙蝠中发现成都肠杆菌、华西杆菌等，还鉴定出梭菌属新物种，为追踪细菌传播途径和流行病学研究提供线索。培养条件方面，哥伦比亚血琼脂平板效果最佳，蝙蝠相关细菌适应较宽温度范围，微需氧环境更利于生长，暗示肠道微生物群中兼性厌氧菌占优势。

未来研究可扩大样本量提高统计效力，深入探讨贵州喀斯特地貌环境对蝙蝠微生物群的影响。

结论

本研究揭示了贵州三种蝙蝠（PB、MB、RB）肠道微生物群在组成和多样性上的显著差异。变形菌门虽普遍存在，但丰度不同。MB 组 OTU 丰富度高，反映出蝙蝠物种多样性、饮食、肠道微生物群和生态动态之间的复杂关系。肠道中大量未知细菌凸显了培养组学方法的重要性。特定分类群对蝙蝠和人类健康可能有潜在影响，后续需开展纵向研究深入探索微生物群的功能及其与宿主健康的关系。