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脊髓小脑共济失调 3 型（SCA3）是一种罕见的神经退行性疾病，目前尚无有效治疗方法。研究人员开展了 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑治疗 SCA3 的研究。结果显示，该方法能有效抑制突变 ataxin-3 产生，修复神经元中受损的高尔基体。这为 SCA3 治疗提供了新策略12。
脊髓小脑共济失调 3 型（Spinocerebellar ataxia type 3，SCA3）是一种常令人闻之色变的神经退行性疾病。它由 ATXN3 基因中 CAG 三核苷酸重复序列异常扩增引起，正常人体内该基因的 CAG 重复数一般在 10 - 44 次，而 SCA3 患者体内却大幅增加到 61 - 87 次 。这一突变使得编码的 ataxin-3 蛋白含有异常延长的多聚谷氨酰胺（PolyQ）链，致使蛋白错误折叠、聚集，产生细胞毒性，最终破坏神经元的正常功能。
目前，针对 SCA3 的治疗策略虽有不少尝试，但都难以取得令人满意的效果。比如，靶向蛋白质质量控制系统，试图减少突变 ataxin-3 蛋白的错误折叠和聚集并促进其降解，然而效果有限；RNA 干扰（RNAi）和反义寡核苷酸（ASOs）等 RNA 基因疗法，虽旨在减少突变 ATXN3 等位基因的转录和翻译，但仍无法从根本上解决问题。在这样的困境下，探寻更有效的治疗方法迫在眉睫。
郑州大学第一附属医院等研究机构的研究人员勇敢地迎接挑战，开展了一项极具意义的研究。他们运用 CRISPR/Cas9 技术，将聚腺苷酸化信号（PAS）精准地插入到 ATXN3 基因中异常 CAG 重复序列的上游，期望能借此阻止异常 CAG 序列的转录，从而消除突变 ataxin-3 蛋白的产生。研究成果令人振奋，该策略不仅有效抑制了突变 ataxin-3 蛋白的生成，还减少了神经元核内包涵体的形成，修复了高尔基体的结构（在 SCA3 细胞中，高尔基体呈现松散、肿大的形态，而经编辑后其结构完整性得到恢复），增加了高尔基体结构蛋白 GM130 和 GORASP2 的表达水平 。这一研究成果发表在《Scientific Reports》上，为 SCA3 的治疗开辟了新的方向。
研究人员开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。首先，利用患者来源的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），这些细胞携带与患者相同的基因突变，是研究疾病机制的良好模型。接着，使用 CRISPR/Cas9 系统对基因进行编辑，通过设计靶向 ATXN3 基因的单导向 RNA（sgRNA），构建靶向载体并导入 iPSCs 中。随后，运用多种检测技术，如 PCR、Sanger 测序用于筛选和验证基因编辑的 iPSCs；免疫荧光染色、蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析蛋白表达和细胞结构变化；还有核型分析、体内畸胎瘤形成实验等检测细胞的多能性和正常核型。
下面来看具体的研究结果：
- 靶向插入 PAS 和删除筛选基因：研究人员筛选出靶向 ATXN3 基因中 CAG 重复序列上游的 sgRNA，经测试发现 Cas9/sgRNA7 切割活性最高。他们构建了包含 SV40 PolyA 序列和嘌呤霉素抗性基因 PuroΔTK 的靶向载体 hES-HPM-001-A，通过 Cre-loxP 系统删除 PuroΔTK，成功获得了 6 个正确的基因编辑单克隆 iPSCs 克隆34。
- 消除 iPSCs 中有毒的 ataxin-3：蛋白质免疫印迹结果显示，SCA3 组能观察到野生型和突变型 ataxin-3 蛋白条带，而基因编辑的 SCA3-GE 组和健康对照组（WT 组）仅出现野生型条带，表明该基因编辑策略有效阻止了 iPSCs 中突变 ataxin-3 蛋白的产生56。
- 基因编辑的 iPSCs 保持多能性和正常核型：通过免疫荧光染色、流式细胞术、体内畸胎瘤形成实验和核型分析等一系列实验证实，基因编辑的 iPSCs 仍保留多能性，能表达多能性蛋白标记，且核型正常，具备分化为内胚层、中胚层和外胚层的能力78。
- 基因编辑的 iPSCs 可分化为神经祖细胞（NPCs）：利用特定试剂盒成功将 iPSCs 分化为 NPCs，免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹结果表明，健康 NPCs、SCA3 患者 NPCs 和 SCA3 基因编辑后的 NPCs 中，PAX6 和 nestin 蛋白的表达水平无显著差异910。
- 靶向插入 PAS 消除神经元中的包涵体：将 iPSCs 和 NPCs 分化为表达 MAP2 和 NeuN 的神经元后，免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹结果显示，SCA3 患者神经元中存在 ataxin-3 聚集，而基因编辑后的神经元和健康神经元中则没有，说明靶向插入 PAS 拯救了神经元中包涵体的形成1112。
- 靶向插入 PAS 修复神经元中的高尔基体：免疫荧光染色和透射电镜（TEM）观察发现，SCA3 患者神经元的高尔基体失去极性，结构松散、面积增大，而基因编辑后的神经元中高尔基体面积减小，结构得到修复，GM130 和 GORASP2 蛋白表达水平升高1314。
综合研究结论和讨论部分，这项研究意义重大。它为 SCA3 及其他三核苷酸重复扩增疾病提供了一种极具前景的基因编辑治疗策略。通过精准的基因编辑，不仅修复了神经元中高尔基体的异常表型，还为自体干细胞移植提供了优质的细胞来源。不过，研究也存在一些不足，如仅对一个细胞系进行了基因编辑，结果可能存在偏差，且基因编辑细胞的体内安全性尚未验证。但总体而言，该研究为神经退行性疾病的治疗带来了新的希望，为后续临床前和临床试验奠定了坚实的理论基础 。
