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本文聚焦于多乳鼠（Mastomys natalensis）巨细胞病毒（CMVs），成功克隆其 3 种病毒基因组为细菌人工染色体（BACs），分析复制能力和宿主范围，确定了适合插入外源基因的位点，为开发基于 MnatCMVs 的拉沙病毒（LASV）疫苗奠定基础。
研究背景
疱疹病毒科（Herpesviridae）的巨细胞病毒（CMVs）是一类双链 DNA 病毒，具有高度的宿主特异性，在宿主群体中广泛感染且通常引发轻微感染，这使其成为有潜力的疫苗载体。多乳鼠（Mastomys natalensis）是拉沙病毒（LASV）的自然宿主，LASV 可导致人类致命的出血热，目前尚无商业化疫苗。近期在多乳鼠中发现了至少三种不同的巨细胞病毒（MnatCMV1、MnatCMV2 和 MnatCMV3），本研究旨在探索 MnatCMVs 作为 LASV 疫苗载体的潜力。
研究方法
- 细胞与病毒：使用多种细胞系，包括 NIH-3T3、BHK-21、293T、REF、MasKECs 和 MasEFs 等。MnatCMV1、MnatCMV2、MnatCMV3 及 MCMV-GFP 等病毒也在研究中使用。
- 质粒：构建多种质粒用于实验，如用于细胞永生化的 pBABE-cLT，用于克隆和筛选的 pCC1BAC-his3 等。
- STAR 克隆：从感染的 MasEFs 上清中提取 MnatCMV DNA，与线性化的 pCC1BAC-his3 载体共转化酵母（Saccharomyces cerevisiae），筛选阳性酵母克隆后转化大肠杆菌（Escherichia coli）。
- BAC DNA 分析：纯化 BAC DNA，进行限制性酶切分析和 Illumina 测序，与亲本病毒基因组序列比对。
- 病毒复制动力学：转染 BAC DNA 重构病毒，制备病毒原液并滴定，在不同细胞系中进行多步复制动力学实验。
- 蛋白与基因表达分析：通过 Western blot 检测病毒蛋白表达，定量 RT-PCR 分析基因转录水平。
- en passant 诱变：用于修复 MnatCMV2 BAC 基因组末端和在 M25 与 m25.1 之间的基因间区域（IGR）插入外源基因。
研究结果
- MnatCMV2 BAC 的构建：通过 STAR 克隆获得 MnatCMV2 的部分基因组克隆，后经 en passant 诱变修复基因组末端，重构的病毒 rMnatCMV2 经测序验证无序列改变，且能在 MasEFs 中产生感染性病毒。
- MnatCMV1 和 MnatCMV3 BAC 的构建：采用改进的 STAR 克隆策略，成功克隆 MnatCMV1 和 MnatCMV3 基因组为 BACs，并重构出感染性病毒 rMnatCMV1 和 rMnatCMV3。
- 复制适应性和宿主范围分析：BAC 来源的 MnatCMVs 在 MasEFs 和 MasKECs 中的复制滴度与亲本病毒相当。MnatCMVs 在小鼠和大鼠成纤维细胞中不复制，在 BHK-21 细胞中仅有 MnatCMV2 出现短暂低水平复制，表明其具有高度的宿主特异性。
- 适合转基因插入位点的鉴定：选择 MnatCMV2 中 M25 和 m25.1 之间的 IGR 进行研究，插入 Kan 标记后不影响病毒复制动力学和相邻基因表达，确定该位点适合插入转基因。
研究结论
本研究成功克隆了三种 MnatCMVs 的基因组为 BACs，保证了病毒的复制适应性和宿主特异性，鉴定了适合插入疫苗抗原基因的位点，为开发基于 MnatCMVs 的 LASV 疫苗迈出了重要一步。不过，开发有效的可传播疫苗仍面临诸多挑战，如疫苗递送、稳定性和安全性等问题，未来需进一步研究。
