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为探究三级淋巴结构（TLSs）对肢端黑色素瘤（AM）及肿瘤微环境（TME）的影响，研究人员分析 46 例患者原发性 AM 病变的 TLS 特征。结果发现，肿瘤内 TLS（intra-TLSs）与患者总生存期改善有关，其相关基因集可预测生存和免疫治疗反应，为 AM 治疗提供新方向。
在癌症研究领域，免疫反应与肿瘤的对抗一直是热门话题。三级淋巴结构（Tertiary lymphoid structures，TLSs）作为免疫系统中的特殊存在，逐渐走进研究者的视野。TLSs 是一种类似于次级淋巴器官（Secondary lymphoid organs，SLOs）的免疫细胞簇，在出生后于非淋巴组织中形成，常见于慢性抗原暴露的部位，比如癌症发生处。它有着独特的结构，包含明确的 T 细胞和 B 细胞区域，以及类似淋巴结的脉管系统，在抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用。
然而，尽管 TLSs 在多种癌症研究中受到关注，但在黑色素瘤领域，大部分研究聚焦于转移性淋巴结或其他器官中的 TLSs，对原发性病变的分析较少。而且以往很多研究依赖组织微阵列，其对组织结构的展示不如数字病理切片扫描清晰。对于肢端黑色素瘤（Acral melanoma，AM）这种特殊亚型的黑色素瘤来说，相关研究更是有限。AM 起源于手掌、脚底和指甲等阳光照射不到区域的黑色素细胞，在亚洲人群中较为常见。与皮肤黑色素瘤（Cutaneous melanoma，CM）相比，AM 的肿瘤突变负担（Tumor mutation burden，TMB）较低，很少有 BRAF 突变，并且处于明显的免疫抑制环境中，对 anti-PD1 单药治疗的反应较差。因此，深入了解 TLSs 在 AM 中的作用迫在眉睫。
为了解决这些问题，南京鼓楼医院（南京大学医学院附属鼓楼医院）的研究人员开展了一项针对 AM 患者的研究。研究人员收集了 46 例 AM 患者的原发性病变样本，运用苏木精 - 伊红（Hematoxylin and eosin，HE）染色和多重复合免疫荧光（Multiplex immunofluorescence，mIF）染色技术，对 TLSs 的特征进行分析，并探究其与患者总生存期（Overall survival，OS）以及肿瘤微环境中免疫细胞浸润的关系。同时，研究人员还对转录组测序数据进行分析，评估与 TLSs 相关的基因集对患者预后和免疫治疗疗效的影响。
研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。样本队列来源于 2013 年 1 月至 2021 年 6 月在南京鼓楼医院就诊的 46 例 AM 患者，所有患者在手术切除原发性病变前均未接受过癌症治疗。通过 mIF 染色和图像分析，研究人员能够观察 TLSs 的结构和特征，量化肿瘤微环境中免疫细胞的比例和分布。利用单样本基因集富集分析（Single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）计算 TLS 特征基因的绝对富集分数。此外，运用多种统计分析软件对数据进行处理和分析。
研究结果主要分为以下几个方面：
- 基线特征：46 例患者纳入分析，中位年龄 68 岁，男女比例接近，根据 TNM 分期系统，各分期患者均有分布，中位随访时间 31.4 个月。通过病理学家评估，TLSs 在 41 例患者中被发现，包括肿瘤周围和肿瘤内的 TLSs。I-II 期患者肿瘤内 TLSs 和早期 TLSs（eTLSs）数量明显多于 III 期患者，性别对 TLSs 数量无显著影响12。
- TLSs 特征与总生存期的关系：通过 Kaplan-Meier 分析发现，有 TLSs 的患者总生存期明显长于无 TLSs 的患者；肿瘤内有 TLSs 的患者总生存期显著长于无肿瘤内 TLSs 的患者，而肿瘤周围 TLSs（peri-TLSs）与总生存期无明显关联，TLSs 的成熟度也与总生存期无关3。
- TLSs 特征与肿瘤内免疫浸润的关系：肿瘤内 TLSs 的存在与肿瘤微环境中 T 细胞（CD4 和 CD8）和 CD8+ T 细胞浸润增加有关，肿瘤周围 TLSs 则与较高比例的 CD68 巨噬细胞相关。进一步量化分析发现，肿瘤内有 TLSs 的患者，其肿瘤细胞周围 50μm 范围内的 CD8+ T 细胞更多，20μm 范围内的 CD68 巨噬细胞更少。同时，肿瘤内有 TLSs 的患者，其 CD68 巨噬细胞与 CD8+ T 细胞的距离更近456。
- TLS 特征基因评分在 AM 中的作用：分析 9 个与 TLSs 相关的特征基因集对患者总生存期和无病生存期（Disease-free survival，DFS）的影响，发现 Th1/B 细胞特征基因集和 TLS 生发中心成熟基因集与总生存期和无病生存期显著相关。进一步研究发现，Th1/B 细胞特征基因集与免疫治疗疗效的相关性更强78。
研究结论表明，肿瘤内 TLSs 可以作为 AM 患者的预后标志物，其存在与患者总生存期的改善以及肿瘤微环境中免疫细胞浸润的增强有关。同时，TLSs 相关的基因集能够预测患者的预后和免疫治疗疗效，特别是 Th1/B 细胞特征基因集在预测治疗反应方面具有很大潜力。这一研究成果发表在《npj Precision Oncology》上，为 AM 的治疗提供了新的方向，有望通过增强 TLSs 的功能来改善患者的临床结局，提高免疫治疗的效果。然而，由于样本量有限，未来还需要更大规模的研究来进一步验证这些发现，并深入探究 TLSs 影响 AM 中免疫细胞浸润的机制。
