qPCR 检测羊混合乳，为布鲁氏菌病防控 “精准导航”

《BMC Veterinary Research》：Can qPCR on pooled sheep milk detect brucellosis as part of herd brucellosis control and eradication programs?

为解决布鲁氏菌病（Brucellosis）检测难题，研究人员开展了利用 qPCR 检测羊混合乳中布鲁氏菌（Brucella spp.）感染的研究。结果显示 qPCR 能有效检测，且最低检测限为每毫升 100 CFU。该方法可用于监测疑似羊群，减少检测次数，对防控布鲁氏菌病意义重大。

　　布鲁氏菌病是一种在全球范围内广泛传播的人畜共患病，给人类健康和畜牧业带来了巨大威胁。在众多感染动物的布鲁氏菌种类中，羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）不仅是引发人类马尔他热的 “罪魁祸首”，还会导致绵羊流产，严重影响羊群繁殖和畜牧业经济效益。而且，在发展中国家，由于传统饮食习惯，人们常食用未经巴氏消毒的乳制品，这使得布鲁氏菌病的传播风险大大增加。

目前，布鲁氏菌病的诊断方法存在诸多缺陷。微生物培养作为 “金标准”，虽准确性高，但细菌生长缓慢，往往需要 3 - 4 天甚至长达两周以上才能出结果，且对实验设施要求严苛，在缺乏先进生物安全和生物安保水平（BSL）设施的情况下难以开展，同时该方法敏感性低，容易出现假阴性结果。血清学检测方法则因部分感染动物无法产生可检测抗体，以及其他革兰氏阴性菌（如耶尔森菌 O:9、大肠杆菌 O157:H7 等）的交叉反应，导致检测结果不准确，出现假阴性或假阳性。

为了攻克这些难题，来自伊朗 Ferdowsi University of Mashhad 的研究人员挺身而出，开展了一项极具意义的研究。他们旨在探索利用定量聚合酶链反应（qPCR）检测羊混合乳中布鲁氏菌感染的可行性，期望找到一种非侵入性、快速且经济高效的检测方法，用于羊群布鲁氏菌病的监测与防控。最终，研究人员成功发现，qPCR 技术能够在混合乳样本中精准检测出布鲁氏菌。这一成果意义非凡，为羊群布鲁氏菌病的防控提供了强有力的新工具，有望大幅减少疾病对畜牧业的危害，保障公众健康，该研究成果发表在《BMC Veterinary Research》杂志上。

研究人员开展该研究时用到了几个主要关键的技术方法：首先，从伊朗东北部 Khorasan - Razavi 县有流产史且血清学检测为布鲁氏菌病阳性的四个农场，随机采集 144 份羊乳样本 。接着，采用 Pokorska 等人 2016 年描述的方法从样本中提取 DNA。之后，利用先前设计的引物，通过常规 PCR 制备分子标准，并进行实时荧光定量 PCR（qPCR）检测，同时绘制标准曲线以评估检测性能。

研究结果如下：

• 标准曲线绘制：研究人员绘制出标准曲线，其方程为y=?3.36X+34.53，效率达 0.986，R2值为 0.9979，这为后续检测提供了可靠的评估依据。
• 检测限评估：微生物培养的检测限较高，每毫升牛奶中至少需要 300 CFU 的羊种布鲁氏菌才能成功分离，当细菌浓度稀释至 200 CFU 时，仅有 40% 的培养样本呈阳性。而 qPCR 表现更为出色，其检测限为每 100 μl 牛奶中 10 CFU 的羊种布鲁氏菌，灵敏度远高于微生物培养。
• 样本检测结果：对 186 份不同组合（包括 6 组每组 24 个样本、12 组每组 12 个样本、24 组每组 6 个样本以及 144 个单个样本）的牛奶样本进行 qPCR 检测后发现，6 组 24 个样本的组中有 4 组呈阳性，12 组 12 个样本的组中有 6 组呈阳性，24 组 6 个样本的组中有 8 组呈阳性；144 个单个样本中，9 个呈阳性，135 个呈阴性 。进一步分析发现，24 样本组检测结果为阴性时，其所有亚组和单个样本检测结果也均为阴性；而 24 样本组检测结果为阳性时，相应亚组和单个样本中至少有一个呈阳性，这表明 qPCR 检测在混合样本检测中具有较高的可靠性。

研究结论和讨论部分指出，qPCR 检测羊混合乳中的布鲁氏菌是一种行之有效的方法。相比传统检测手段，它具有诸多优势：非侵入性，避免了对动物的伤害；检测速度快，能在短时间内得出结果；成本效益高，可通过混合样本检测减少检测次数和试剂消耗。不过，该方法也存在一定局限性，如需要采集牛奶样本，且样本采集时间会影响检测准确性 。但总体而言，qPCR 在羊群布鲁氏菌病监测方面具有重要价值，可作为血清学检测呈阳性后的补充检测手段，有助于精准识别感染动物，及时消除羊群中的传染源，降低经济损失，保障公众健康，为全球布鲁氏菌病防控工作提供了新的思路和有力支持。