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为探究疙瘩皮肤病病毒（LSDV）的致病机制，华南农业大学和吉林大学的研究人员开展了关于 LSDV ORF142 蛋白作用机制的研究。结果发现 ORF142 蛋白通过阻断 TBK1 和 IRF3 的相互作用抑制 I 型干扰素（IFN-I）产生。该研究为 LSDV 防治提供了新依据。
在广袤的畜牧养殖领域，疙瘩皮肤病（Lumpy Skin Disease，LSD）就像一个隐藏的 “恶魔”，严重威胁着牛羊等反刍动物的健康，给全球养牛业带来了巨大损失。这种疾病由疙瘩皮肤病病毒（Lumpy Skin Disease Virus，LSDV）引起，它是一种双链 DNA 病毒，虽然其基因组包含众多开放阅读框（Open Reading Frames，ORFs），但目前人们对其致病机制却知之甚少。此前研究发现，LSDV 的 142 基因缺失会影响病毒在细胞中的增殖，且 ORF142 蛋白能抑制干扰素 β（Interferon-β，IFN-β）的产生，可具体的作用机制并不清楚。为了深入了解 LSDV 的免疫逃逸机制，找到防治这种疾病的新方向，华南农业大学和吉林大学的研究人员展开了一系列研究。他们的研究成果发表在《BMC Veterinary Research》上，为我们揭开了 LSDV 的神秘面纱。
研究人员在此次研究中，运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，使用了人胚肾 293T（HEK-293T）细胞和非洲绿猴肾细胞（Vero）等多种细胞系 。通过共免疫沉淀（Co-IP）技术，来检测蛋白质之间的相互作用；利用蛋白质免疫印迹（Western blotting）技术，分析蛋白质的表达和磷酸化水平；借助实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR），测定相关基因的表达量；采用双荧光素酶报告基因（DLR）实验，评估干扰素启动子的活性；运用共聚焦显微镜技术，观察蛋白的定位和共定位情况。
ORF142 抑制 IRF3-5D 介导的 IFN-β 产生
研究人员将 Flag-IRF3、HA-IRF3-5D 和 GFP-ORF142 转染到 HEK-293T 细胞中，通过 RT-qPCR 检测发现，ORF142 显著抑制了 IRF3 活性形式（IRF3-5D）诱导的 IFN-β、ISG15、ISG54 和 ISG56 的表达。同时，DLR 基因检测结果表明，ORF142 显著抑制了 IFN-I 和干扰素刺激反应元件（Interferon-stimulated Response Element，ISRE）启动子的激活。这一系列实验结果说明，ORF142 对 IRF3 介导的 IFN-β 产生具有抑制作用。
IRF3 与 ORF142 在病毒感染过程中相互作用
IRF3 作为诱导 IFN-I 的主要转录因子，研究人员推测它与 ORF142 之间存在某种关联。实验中，将 GFP-ORF142 与 mCherry-IRF3 等共转染到 293T 细胞，进行 Co-IP 实验，结果显示 GFP-ORF142 能与 mCherry-IRF3 免疫共沉淀，证实了二者存在相互作用。研究人员进一步构建了 IRF3 的截断突变体进行实验，发现 ORF142 与 IRF3 的 381 - 417 氨基酸区域相互作用，且通过共聚焦显微镜观察到二者的共定位，表明 ORF142 能抑制 IRF3 的核转位。
ORF142 抑制 IRF3 的磷酸化
为了进一步探究 ORF142 对 IFN-β 产生的影响，研究人员分析了 IRF3 的磷酸化情况。将 Vec-GFP 和 GFP-ORF142 分别转染到 Vero 细胞，用仙台病毒（Sendai virus，SEV）刺激后进行 Western blotting 检测，发现 ORF142 能剂量依赖性地抑制 IRF3 的磷酸化。同时，用野生型 LSDV（LSDV WT）和 142 基因缺失株（LSDV △142）感染 293T、Vero 和 MDBK 细胞，结果显示 LSDV WT 感染的细胞中 IRF3 磷酸化明显受到抑制，而 LSDV △142 感染的细胞中 IRF3 磷酸化水平较高，这表明 ORF142 干扰了 IRF3 的激活。
ORF142 抑制 TBK1 与 IRF3 的结合
在病毒感染阶段，cGAS 识别病毒 DNA 并激活 cGAS-STING-TBK1-IRF3 轴，从而诱导 IFN-I 和干扰素刺激基因（Interferon-stimulated Genes，ISGs）的表达。研究人员将 Vec-GFP、GFP-ORF142 与 Flag-TBK1、mCherry-IRF3 共转染到 293T 细胞，进行免疫沉淀实验，发现 ORF142 能剂量依赖性地抑制 TBK1 与 IRF3 的结合。通过共聚焦显微镜观察发现，在未感染 SEV 的细胞中，无论是否过表达 ORF142，IRF3 都分布在细胞质中；感染 SEV 且未过表达 ORF142 时，IRF3 能有效转位到细胞核，而表达 ORF142 时，SEV 诱导的 IRF3 核转位受到严重损害。这表明 LSDV ORF142 在病毒感染阶段通过抑制 IRF3 核转位来应对病毒感染。
综合上述研究结果，研究人员得出结论：LSDV ORF142 蛋白是病毒逃避宿主先天免疫反应的关键因素。它直接与 IRF3 结合，阻断 IRF3 与 TBK1 的相互作用，抑制 IRF3 的磷酸化和核转位，进而有效抑制 IFN-β 的产生。这一免疫逃避策略揭示了 LSDV 与宿主抗病毒防御相互作用的复杂性，也为痘苗病毒逃避先天免疫系统关键组件的机制提供了新的见解。
在讨论部分，研究人员指出，TBK1-IRF3 复合物的激活对于产生 IFN-β 至关重要，它在宿主对抗病毒感染的先天免疫反应中起着关键作用。然而，病毒如何绕过这一途径逃避免疫的调控机制尚不清楚。该研究发现 LSDV ORF142 蛋白直接与 IRF3 相互作用，破坏其与 TBK1 的结合，阻止 IRF3 核转位，这揭示了 ORF142 在 LSDV 免疫逃逸中的关键作用，也突出了痘苗病毒对宿主抗病毒信号通路的调控方式。此外，许多病毒都进化出了抑制 IRF3 激活的策略来逃避宿主的抗病毒防御，LSDV ORF142 通过靶向 IRF3 的 381 - 417 氨基酸区域，阻止其磷酸化和核转位，从而阻断 IFN-β 和其他抗病毒细胞因子的产生，这是痘苗病毒家族中一种尚未被描述的机制。该研究不仅有助于更深入地理解病毒对 IRF3 的拮抗作用，也为开发针对 LSDV 及相关病毒感染的治疗策略提供了新的思路。例如，可以探索能够阻断 ORF142 与 IRF3 结合的小分子或肽，作为潜在的抗病毒药物；增强 TBK1-IRF3 通路的活性，也可能是对抗其他痘苗病毒免疫抑制的有效策略。总之，这项研究为病毒致病机制和免疫调节的研究奠定了基础，具有重要的理论和实践意义。
