揭示茶树抗煤烟病关键 miRNA - 靶标网络：为培育抗病品种点亮新希望

《BMC Plant Biology》：Uncovering the key miRNA-target network of tea plants in resistance to sooty mold disease

为解决茶树煤烟病（SM）严重威胁茶树健康，导致产量和品质下降的问题，研究人员开展了茶树对 SM 抗性机制的研究。通过多组学分析，揭示了关键的 miRNA - 靶标网络，这为培育抗 SM 品种提供了靶点，对保障茶叶生产意义重大。

　　煤烟病（Sooty mold，SM）如同茶树的 “黑色幽灵”，悄然而至又破坏力巨大。在热带和亚热带地区，它常常现身于茶树的叶片和果实表面，那层黑乎乎、毛茸茸的覆盖物，不仅严重阻碍了茶树的光合作用，还大大降低了茶叶的产量和品质。随着气候变化和集约化农业的发展，煤烟病在我国的发生愈发频繁，茶农们为了对抗它，不得不依赖化学杀菌剂，这又带来了环境污染等一系列问题。然而，茶树抵抗煤烟病的分子机制却一直蒙着神秘的面纱，亟待科学家们去揭开。

为了探寻这一谜题，山东农业科学院茶叶研究所和安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室的研究人员挺身而出，开展了一项深入的研究。他们的研究成果发表在《BMC Plant Biology》上，为茶树抗煤烟病的研究带来了新的曙光。

研究人员运用了多种关键技术方法。他们采集了不同煤烟病感染程度的茶树叶片样本（分为健康、中度感染和重度感染三组），然后进行转录组（transcriptome）、sRNA 组（sRNAome）和降解组（degradome）测序分析。通过这些测序技术，他们能够全面地获取茶树在感染煤烟病过程中的基因表达变化信息。同时，还利用了 5′ RLM - RACE 技术验证 miRNA 的靶标切割位点，运用 qRT - PCR 技术对基因表达进行验证，通过基因共表达分析（Co - expression analysis）构建调控网络，以及采用瞬时双荧光素酶报告基因检测（Transient dual - luciferase assay）来探究 miRNA 与靶基因之间的相互作用。

研究结果如下：

1. 田间观察与症状：2023 年 9 - 10 月，山东省茶园大规模爆发煤烟病。患病茶树叶片起初出现小黑斑，随后逐渐扩大，严重时叶片几乎被黑色煤粉状物质完全覆盖，病斑还会蔓延至小枝、茎甚至整株茶树。
2. 转录组测序与分析：测序得到高质量数据，主成分分析（PCA）显示数据可靠。共鉴定出 760 个差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs），且感染叶片中下调的 DEGs 数量多于上调的。GO 注释表明，这些 DEGs 主要富集在木质素生物合成、苯丙烷类分解代谢和植物细胞壁生物发生等过程；KEGG 分析显示，主要富集在代谢途径、特殊代谢物生物合成和异黄酮生物合成等通路。
3. 不同表达模式的 DEGs：不同感染程度下，DEGs 呈现出不同的表达模式。健康叶片样本中，DEGs 主要富集在细胞壁生物发生等过程；中度感染样本中，与黄酮类生物合成等相关的基因表达；重度感染样本中，与特殊代谢过程、苯丙烷类和木质素分解代谢以及对真菌防御反应相关的基因表达上调，这表明茶树在重度感染时免疫反应增强。
4. SM 调控的 miRNA 鉴定：通过深度测序，共鉴定出 451 个已知成熟 miRNA 和 1619 个新的成熟 miRNA。在感染过程中，共发现 197 个差异表达 miRNA（Differentially expressed miRNAs，DEmiRNAs），包括 97 个已知的和 100 个新的，它们在不同感染程度下呈现出多样的表达模式。
5. 靶标预测与降解组分析：降解组测序验证了 1095 个 miRNA 的靶基因，GO 富集分析显示这些靶基因主要与叶绿体、细胞溶质、对生长素的响应和对光刺激的响应等相关；KEGG 分析表明，主要与植物激素信号转导、光合作用和乙醛酸及二羧酸代谢等与病原体响应密切相关的通路有关。
6. SM 响应的 miRNA 与靶标表达谱的相关性分析：结合 DEmiRNAs 和其靶基因表达谱，发现 37 个 miRNA - 靶标对呈现反向表达模式。例如，新 miRNA PC - 5p - 33681_128 在重度感染时表达上调，而其靶基因 CSS0031673（Auxin - responsive protein）表达下调。5′ RLM - RACE 和 qRT - PCR 验证了这些结果与测序数据相符。
7. 基因共表达网络分析：利用转录组、sRNA 组和降解组数据进行共表达分析，发现 9 个模块簇，聚焦于 DEmiRNA 及其差异表达靶标，确定了 CsARF（受 PC - 5p - 33681_128 靶向）和 CsALDH（受 ppe - MIR535b - p3 - 1ss12TC 靶向）两个关键靶基因，它们在基因网络中与众多基因相互作用，且与植物激素信号转导、植物 - 病原体相互作用和特殊代谢物生物合成相关。
8. miRNA 与关键基因相互作用的验证：5′ RLM - RACE、qRT - PCR 和瞬时双荧光素酶检测表明，CsARF 是 PC - 5p - 33681_128 的直接靶标，CsALDH 是 ppe - MIR535b - p3_1ss12TC 的直接靶标，相应的 miRNA 可通过转录后抑制调控靶基因表达。

研究结论与讨论部分指出，该研究揭示了茶树对煤烟病感染响应的新 miRNA - 靶标网络，这一网络涉及复杂的调控机制。在感染过程中，茶树的免疫反应随着感染程度的变化而变化，中度感染时免疫反应减弱，重度感染时则通过调节特殊代谢和植物 - 病原体相互作用重新激活免疫。CsARF 和 CsALDH 在调控茶树对煤烟病的防御中起重要作用，PC - 5p - 33681_128 和 ppe - MIR535b - p3_1ss12TC 通过 mRNA 切割参与茶树的免疫反应。这些发现加深了我们对茶树免疫分子基础的理解，为通过基因工程或标记辅助选择培育抗煤烟病茶树品种提供了潜在靶点，对保障茶叶生产、减少经济损失、降低化学杀菌剂对环境的危害具有重要意义，也为全球茶叶产业应对气候变化、实现可持续发展提供了有力支持。