蕨类植物 bHLH 基因家族探秘：揭示木质素合成调控机制与进化奥秘

《BMC Genomics》：Genome-wide identification of five fern bHLH families and functional analysis of bHLHs in lignin biosynthesis in Alsophila spinulosa

为探究蕨类植物 bHLH 基因家族及其在木质素合成中的作用，四川农业大学等研究人员对 5 种蕨类植物进行研究。他们发现 bHLH 基因数量与蕨类生长形态相关，还确定了 3 个可能参与木质素合成调控的基因，为理解植物次生代谢提供依据。

　　在神奇的植物世界里，蕨类植物作为地球上第二大维管植物类群，一直吸引着众多科研人员的目光。维管组织对于植物而言，就像人类的血管系统，不仅为植物提供物理支撑，还承担着运输水分、糖分、激素等重要物质的重任。而蕨类植物的维管系统中，木质部含有大量木质素，这对于其结构和功能至关重要。

bHLH（basic helix-loop-helix）转录因子作为植物中广泛存在的一类转录因子，参与了众多生物学过程，尤其是在次生代谢产物的生物合成中发挥着关键作用。在许多植物中，bHLH 转录因子对木质素生物合成的调控已有研究，但在蕨类植物中，相关研究却极为有限。

目前，虽然已经有 5 种蕨类植物的基因组被公布，但 bHLH 基因家族在蕨类植物中的基因组水平研究以及其在木质素生物合成中的作用仍不明确。这就好比在一幅拼图中，缺失了关键的几块，使得我们无法完整地了解蕨类植物的生长和进化机制。

为了填补这些空白，四川农业大学等研究机构的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们对 5 种蕨类植物，包括桫椤（Alsophila spinulosa）、鹿角蕨（Platycerium wallichii）、满江红（Azolla filiculoides）、槐叶苹（Salvinia cucullata）和栗蕨（Ceratopteris richardii）的 bHLH 基因家族进行了系统研究。

研究人员通过一系列实验和分析，得出了许多重要结论。首先，他们在 5 种蕨类植物中总共鉴定出 561 个 bHLH 基因。桫椤拥有最多的 bHLH 基因，达到 186 个，这一数量与蕨类植物的生长形态和生活习性密切相关，树蕨类的 bHLH 基因数量明显多于其他蕨类。

通过系统发育分析，研究人员将这些 bHLH 基因分为 28 个亚家族。这一分类有助于了解不同亚家族基因的进化关系和功能差异。同时，研究发现基因复制在蕨类植物 bHLH 基因家族的进化中起着关键作用。串联重复是栗蕨、鹿角蕨和桫椤 bHLH 基因多样性的关键驱动力，而片段重复则对桫椤 bHLH 基因的扩张和进化贡献更大。

在研究基因表达模式时，研究人员发现 AspbHLH 基因在不同组织中呈现出特异性表达。例如，一些基因在叶片中高度表达，可能与叶片发育和抗逆性相关；而 AspbHLH80、AspbHLH120 和 AspbHLH185 这 3 个基因则在木质部中特异性高表达。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）和下游靶基因预测，研究人员推测这 3 个基因可能在木质素生物合成中发挥调控作用。

为了进一步验证这些推测，研究人员进行了亚细胞定位实验，发现这 3 个基因均位于细胞核中，这与转录因子在细胞核中发挥调控作用的特性相符。

这项研究成果发表在《BMC Genomics》上，具有重要意义。它为我们深入理解蕨类植物木质形成的机制和调控网络提供了关键线索，推动了我们对植物次生代谢的认识。同时，这些发现也为植物生物技术和遗传改良提供了重要的理论基础，在农业、林业和生物能源等领域具有潜在的应用价值。

研究人员在开展研究时，主要运用了以下关键技术方法：

1. 基因鉴定与分类：从多个数据库获取 5 种蕨类植物的基因组数据，利用隐马尔可夫模型（HMM）和相关在线工具鉴定 bHLH 基因，并进行分类。
2. 系统发育分析：构建 5 种蕨类植物和拟南芥（Arabidopsis thaliana）bHLH 蛋白的系统发育树，分析基因的进化关系和亚家族分布。
3. 表达模式分析：通过转录组数据和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析 AspbHLH 基因在不同组织中的表达情况。
4. 加权基因共表达网络分析（WGCNA）：利用转录组数据进行 WGCNA，确定与木质部相关的模块和基因，预测潜在的调控关系。
5. 亚细胞定位：构建带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的表达载体，通过农杆菌介导转化烟草叶片，利用共聚焦显微镜观察基因的亚细胞定位。

研究结果具体如下：

1. bHLH 基因的鉴定与分类：研究人员在 5 种蕨类植物中鉴定出 561 个 bHLH 基因，桫椤的 bHLH 基因数量最多。这些基因编码的蛋白质平均分子量和等电点各不相同，且大部分预测定位于细胞核。通过系统发育分析，将这些基因分为 28 个亚家族，不同亚家族的基因数量在 5 种蕨类植物中存在显著差异。
2. 基因结构和蛋白基序多样性：561 个 bHLH 基因的结构差异显著，同一亚家族的基因往往具有相似的外显子 / 内含子结构和蛋白基序分布。这表明基因结构和基序分布与基因功能可能存在关联。
3. 顺式调控元件多样性：在 bHLH 基因的启动子区域预测到 561 个顺式调控元件（CREs），主要包括光响应元件、植物激素响应元件和非生物胁迫响应元件等。其中，茉莉酸甲酯（MeJA）和脱落酸（ABA）响应元件数量较多，暗示它们在调控 bHLH 基因表达中起重要作用。
4. 染色体分布和进化分歧：对桫椤、鹿角蕨和栗蕨的 bHLH 基因进行染色体定位分析，发现这些基因在染色体上的分布存在差异。同时，鉴定出了基因的串联重复和片段重复事件，大部分串联重复基因在进化过程中受到纯化选择。
5. AspbHLH 基因的表达模式：AspbHLH 基因在 5 种组织中呈现出不同的表达模式，部分基因具有组织特异性表达。如 AspbHLH80、AspbHLH120 和 AspbHLH185 在木质部中高表达，预测其下游靶基因包含许多调控木质素合成的转录因子。
6. 关键 AspbHLH 基因的鉴定：通过 WGCNA 分析，发现黄色模块与木质部高度相关，AspbHLH80、AspbHLH120 和 AspbHLH185 位于该模块，且与木质素合成相关的关键酶基因共表达，进一步支持了它们在木质素生物合成中的潜在作用。
7. AspbHLHs 的亚细胞定位：预测并验证了 AspbHLH80、AspbHLH120 和 AspbHLH185 定位于细胞核，表明它们可能参与基因表达的调控。

研究结论和讨论部分表明，bHLH 基因家族在蕨类植物的生长、发育和适应环境过程中发挥着重要作用。基因复制事件是蕨类植物 bHLH 基因家族进化的主要驱动力，不同的复制方式在不同物种中发挥着不同的作用。组织特异性表达的 AspbHLH 基因暗示了它们在植物不同组织中的多样功能，尤其是在木质素生物合成和维管组织发育方面。

然而，研究也存在一些局限性。虽然预测了 AspbHLH80、AspbHLH120 和 AspbHLH185 在木质素生物合成中的调控作用，但具体的调控机制仍有待进一步研究。未来的研究可以通过基因过表达或沉默实验，结合代谢物分析和染色质免疫沉淀（ChIP）等技术，深入探究这些基因的功能和调控网络。

总的来说，这项研究为蕨类植物 bHLH 基因家族的研究提供了重要的参考，为进一步揭示植物木质素合成的奥秘奠定了坚实的基础，也为植物生物技术和遗传改良开辟了新的思路和方向。