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为解决诱导基因表达电路中 DNA 甲基化导致的基因沉默及 A2UCOE（A2 - 泛染色质开放元件）引起的基因渗漏问题，纽约大学研究人员开展了相关研究。结果发现 SV40 poly - A 终止序列可消除基因渗漏，增强抗沉默效果。这对基因电路设计及 iPSCs 应用意义重大。
在生命科学的前沿探索中，基因表达的精准调控一直是科研人员关注的焦点。诱导基因表达电路在生物研究和细胞治疗等领域具有重要作用，它能够像精准的开关一样，控制目标基因的激活，在直接重编程技术中广泛应用。直接重编程（direct reprogramming）可以将一种细胞类型直接转化为另一种细胞类型，通过强制过表达主转录因子实现，为再生医学带来了新的希望。然而，这一过程却面临着重重阻碍。DNA 甲基化就像基因的 “封印”，常常导致基因沉默，尤其是在诱导多能干细胞（iPSCs）中，这使得基因电路失去活性，无法实现长期可扩展的细胞类型扩增，严重限制了其在实际应用中的效果。
A2 - 泛染色质开放元件（A2UCOE）因其具有抗沉默特性而备受关注，它位于人类 7 号染色体上，包含一个大的 CpG 岛，能维持开放染色质结构，理论上可以抵抗 DNA 甲基化，防止基因沉默。但此前，它从未在人类 iPSCs 的诱导系统中用于直接重编程。为了突破这些困境，来自纽约大学（New York University）的研究人员踏上了探索之旅，他们希望揭示 A2UCOE 在诱导系统中的作用，找到消除相关基因渗漏的策略，让工程化的人类 iPSCs 能够长期稳定地发挥作用。
研究人员首先构建了一个紧凑的一体化基因电路，这个电路集成了强力霉素（doxycycline）诱导的 Tet - On 系统、863bp 的 A2UCOE 以及对胸腺上皮细胞（TEC）分化至关重要的转录因子 FOXN1。他们利用 CRISPR/Cas9 辅助的同源定向修复（HDR）技术，将这个基因电路精准地整合到人类 iPSCs 的安全港位点 Rogi1 上。
为了评估基因表达的稳定性，研究人员进行了一系列实验。通过分析 ATAC - seq 数据，他们发现 A2UCOE 所在区域具有较高的转录活性。在细胞培养实验中，他们对比了含有 0.9kb A2UCOE 和不含 A2UCOE 的基因编辑细胞群体。结果显示，在培养 30 天后，含有 A2UCOE 的细胞群体中，RFP 阳性（mScarlet +）细胞的比例显著高于不含 A2UCOE 的群体，这表明 A2UCOE 能够促进基因编辑 iPS 细胞中基因的长期稳定表达，并且细胞对强力霉素的响应也更好，能够有效诱导目标基因 FOXN1 的表达。
然而，研究人员也发现了一个意外的问题 —— 即使在没有强力霉素的情况下，FOXN1 基因也出现了渗漏现象。这导致 iPSCs 提前分化为 TECs，限制了细胞的持续使用。为了深入探究 A2UCOE 与基因渗漏之间的关系，研究人员构建了不同长度的 A2UCOE 片段（1337bp、749bp 和 547bp），并将它们整合到 iPSCs 中进行研究。结果发现，所有长度的 A2UCOE 片段都会导致显著的基因渗漏，而且在基因表达稳定性方面，至少 0.7kb 的 A2UCOE 片段对维持转录水平有积极影响，而较短的 CBX - only UCOE 片段则不足以维持转录。
为了解决基因渗漏问题，研究人员提出了一个假设：在 A2UCOE 和 TRE 启动子之间插入富含 AT 的间隔序列，可能会减少基因的渗漏表达。他们设计并合成了多个不同 AT 含量的随机间隔序列，以及含有 SV40 poly - A 终止序列的间隔序列，并将它们分别整合到基因电路中进行测试。实验结果令人惊喜，SV40 poly - A 间隔序列显著降低了 FOXN1 的渗漏，几乎达到了与对照组相同的水平，同时还增强了 A2UCOE 的抗沉默效果，相比仅含有 A2UCOE 的组，抗沉默效果提升超过 60%。而且，这个新的基因电路架构并没有影响 Tet - On 系统的药物诱导基因表达功能，在添加强力霉素后，FOXN1 的转录仍然能够显著诱导。
在讨论部分，研究人员深入分析了 A2UCOE 导致基因渗漏的机制。他们认为，A2UCOE 促进的开放染色质可能使得 RNA 聚合酶 II（RNAPII）在没有激活因子的情况下，也能在两个转录方向上结合和延伸，从而导致基因渗漏。而 SV40 poly - A 终止序列能够有效消除基因渗漏，可能是因为它招募了终止因子，如多聚腺苷酸聚合酶和多聚腺苷酸结合蛋白（PABPC），进行 3’端加工和终止基础转录，同时也可能阻止了反向的假转录本，避免了其对复制的干扰，进而增强了抗沉默效果。
这项研究成果发表在《Journal of Biological Engineering》上，具有重要的意义。它揭示了 A2UCOE 在诱导系统中的新局限性，为基因电路的设计提供了关键的参考。在未来的基因治疗、再生医学以及细胞治疗等领域，研究人员可以根据这些发现，更加合理地设计基因电路，避免基因渗漏和沉默带来的问题，提高治疗效果。同时，也为进一步研究转录终止如何调节基因沉默提供了新的方向，推动了哺乳动物合成生物学的发展。
研究人员在开展这项研究时，主要运用了以下关键技术方法：一是利用 CRISPR/Cas9 辅助的同源定向修复（HDR）技术，实现基因电路在基因组安全港位点 Rogi1 的精准整合；二是通过定量实时 PCR（qPCR）技术，对基因表达水平进行定量分析，评估基因的转录情况；三是采用免疫荧光染色技术，直观地观察细胞中特定蛋白的表达情况，判断细胞的分化状态。样本队列来源为从 George Church 实验室获得的人类 iPSC 系 PGP1。
研究结果具体如下：
- “一体化” Tet - On 系统的开发：构建了一种 “一体化” Tet - On 系统，该系统包含所有 Tet - On 控制机制，可通过 CRISPR/Cas9 辅助的 HDR 技术整合到目标基因组区域，实现对目标基因的强力霉素诱导表达。
- 0.9UCOE 增强基因编辑 iPS 细胞的长期基因表达：0.9kb 的 A2UCOE 可促进基因编辑 iPS 细胞中基因的长期稳定表达，在培养 30 天后，含有 0.9UCOE 的细胞群体中 RFP 阳性细胞比例更高，且对强力霉素诱导目标基因 FOXN1 的表达响应更好。
- 预诱导胸腺上皮细胞系的建立及向诱导胸腺上皮细胞的分化：成功建立了含有 FOXN1 基因电路的预诱导胸腺上皮细胞系 pre - iTEC1，该细胞系在强力霉素处理后可分化为诱导胸腺上皮细胞（iTEC），表现为细胞形态改变，多能性标记基因表达下降，TEC 标记基因表达上升。
- 0.9UCOE 诱导 iPS 细胞的基因渗漏和过早分化：0.9UCOE 会导致 iPS 细胞中 FOXN1 基因渗漏，即使在没有强力霉素的情况下，也会使细胞过早分化，多能性标记基因表达降低，TEC 标记基因表达增加。
- 使用不同长度的 A2UCOE 片段评估基因稳定性和基因渗漏：不同长度的 A2UCOE 片段均会导致基因渗漏，至少 0.7kb 的 A2UCOE 片段对维持转录水平有积极影响，而 CBX - only UCOE 片段则效果不佳，但所有 A2UCOE 片段都能维持诱导基因表达功能。
- SV40 poly - A 间隔序列减轻 A2UCOE 引起的基因渗漏：SV40 poly - A 间隔序列可有效消除 A2UCOE 引起的基因渗漏，同时增强其抗沉默效果，且不影响 Tet - On 系统的药物诱导基因表达功能。
总的来说，该研究揭示了 A2UCOE 在双向诱导基因电路中会导致意外的基因渗漏，进而引起 iPS 细胞的过早分化。这一发现为直接重编程基因电路的设计敲响了警钟，尤其是在维持细胞多能性至关重要的情况下，如 iPS 细胞和胚胎干细胞（ES cells）的研究与应用中。同时，研究提出的在转录单元之间引入 SV40 poly - A 序列的策略，为优化基因电路设计提供了新的思路，对未来基因治疗和细胞治疗等领域的发展具有重要的指导意义。
