单细胞及空间转录组分析揭示非小细胞肺癌新辅助化疗免疫治疗后肿瘤微环境重塑机制

《Molecular Cancer》：Single-cell and spatial transcriptomic analyses revealing tumor microenvironment remodeling after neoadjuvant chemoimmunotherapy in non-small cell lung cancer

非小细胞肺癌（NSCLC）患者对新辅助免疫化疗的疗效存在差异。为探究其影响，研究人员对 12 例 NSCLC 患者的肿瘤组织进行单细胞 RNA 和空间转录组测序。结果揭示了肿瘤微环境的动态变化，为提高治疗效果提供依据，助力精准治疗。

　　肺癌，这个 “癌症杀手”，长期以来严重威胁着人类的生命健康。在全球范围内，肺癌是导致癌症患者死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占据了肺癌病例的 85%。近年来，免疫疗法的出现为 NSCLC 患者带来了新的希望，新辅助免疫疗法联合化疗更是成为了 NSCLC 的一线治疗方案。然而，并非所有患者都能从中获益，部分患者对免疫检查点阻断（ICB）治疗无响应，而且免疫疗法耐药的机制也尚不明确。肿瘤微环境（TME）在肿瘤的发展、转移以及对治疗的敏感性方面起着关键作用，但是 ICB 对 NSCLC 中 TME 的重塑影响，以及 TME 对 ICB 反应性的改变如何影响治疗效果，都有待深入研究。

为了深入了解 NSCLC 患者在接受新辅助化疗免疫治疗后 TME 的动态变化，中国医科大学的研究人员开展了一项全面且深入的研究。他们对 12 例接受肿瘤手术切除的 NSCLC 患者的肿瘤组织样本进行了单细胞 RNA 测序和空间转录组测序，还利用两个独立的 NSCLC 患者队列对部分研究结果进行了验证。该研究发表在《Molecular Cancer》上，为 NSCLC 的治疗提供了重要的理论依据和潜在的治疗靶点。

在研究方法上，研究人员收集了 12 例 NSCLC 患者的肿瘤组织样本，其中 6 例患者在手术前接受了 3 - 5 个周期的新辅助免疫治疗（PD - L1 阻断）联合顺铂化疗，另外 6 例患者直接接受手术未进行新辅助治疗。通过肿瘤解离试剂盒将新鲜肿瘤组织制备成单细胞悬液，进行单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）。同时，对 4 例不同病理反应的患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片进行空间转录组测序。利用多种生物信息学方法对数据进行质量控制、分析和注释，还通过多种实验技术进行验证。

研究结果如下：

1. 高分辨率单细胞和空间转录组分析描绘 NSCLC 患者化疗免疫治疗后 TME 景观：研究人员对单细胞转录组和空间转录组数据进行分析，将细胞注释为 8 种类型，发现化疗免疫治疗后成纤维细胞数量显著增加，不同患者的细胞簇比例存在很强的异质性。通过空间转录组分析，在部分患者组织中发现了三级淋巴结构（TLSs），TLSs 的存在与免疫治疗反应良好相关。此外，还确定了不同细胞类型的空间分布和相邻关系，表明肿瘤组织呈现出多样化的细胞结构，TME 景观在化疗免疫治疗后发生了动态变化。
2. 化疗免疫治疗增强恶性细胞的细胞代谢并在正常上皮细胞中诱导免疫抑制微环境：研究人员对上皮细胞进行分析，将其分为 8 个亚群，发现恶性细胞主要起源于基底细胞。化疗免疫治疗后，恶性细胞的代谢功能增强，正常上皮细胞的免疫相关通路被抑制，呈现出免疫抑制微环境。通过免疫组化染色验证了相关信号通路的变化。同时，研究还揭示了上皮细胞的发育轨迹，以及不同细胞类型在肿瘤组织中的空间分布和距离变化。
3. 免疫治疗抑制 Th17 CD4⁺ T 细胞的分化和功能并使 CD4⁺ T 细胞免于耗竭：研究人员对 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞进行研究，发现免疫治疗后 Th17 细胞数量显著减少，Th17 细胞的分化和功能受到抑制，同时 CD4⁺ T 细胞的耗竭标记降低。在应答者中，Th17 细胞的比例升高，Treg 细胞的比例降低，Th17/Treg 比值升高，这与免疫治疗的良好反应相关。通过重建 CD4⁺ T 细胞的分化轨迹，确定了与细胞分化相关的特征基因和信号通路。
4. 化疗免疫治疗的应答者在 NSCLC 肿瘤中表现出效应 CD8⁺ T 细胞的浸润显著增加：研究人员对 CD8⁺ T 细胞进行聚类分析，发现新辅助治疗显著抑制了 CD8⁺ T 细胞的耗竭标记，增强了其细胞毒性。Teff - KLRG1 细胞在联合治疗后数量减少，其功能存在争议；Teff - ZNF683^high细胞在免疫治疗后转变为失活和抗原呈递表型。通过构建细胞分化轨迹，确定了与 CD8⁺ T 细胞发育相关的基因和信号通路，并且发现 CD8⁺ T 细胞的浸润水平与化疗免疫治疗的应答相关。
5. 抗 PD - L1 治疗增加 IgG⁺浆细胞的浸润并增强浆细胞与 CAFs / 巨噬细胞之间的通讯：研究人员对 B 细胞进行分析，将其分为 5 个亚群，发现联合治疗后浆细胞亚型减少，记忆 B 细胞亚型增加。通过构建 B 细胞分化轨迹，确定了与细胞分化相关的基因和信号通路。在空间分布上，浆细胞和滤泡 B 细胞在 pCR 和应答者组织中浸润明显增加，且浆细胞与 CAFs 和巨噬细胞在应答者中显著共定位，表明其与抗 PD - L1 治疗的阳性反应相关。
6. 化疗免疫治疗显著改变 CXCL9 和 SPP1 巨噬细胞的比例并增强 NSCLC TME 中 TAMs 的浸润：研究人员对髓系细胞进行聚类分析，重点研究巨噬细胞亚群，发现化疗免疫治疗后巨噬细胞的 M1 标记显著升高，M2 标记显著降低，CXCL9 巨噬细胞比例显著升高，其抗原呈递和免疫激活功能增强。通过构建巨噬细胞分化轨迹，发现联合治疗促进了巨噬细胞向 Mφ - CXCL9 和 Mφ - SELENOP 的分化。空间分析表明，SELENOP 巨噬细胞在应答者组织中显著增加，与 CAFs、T 细胞和肿瘤细胞共定位。
7. 化疗免疫治疗通过改变基质 CAFs 和炎性 CAFs 的比例并增强抗原呈递 CAFs 的活性来重塑 TME：研究人员将癌症相关成纤维细胞（CAFs）分为 5 个亚群，发现联合治疗显著改变了 CAFs 的分布和功能。apCAFs 在 PT 组中比例显著降低，但抗原呈递功能增强；iCAFs 在 pCR 样本中比例较高，可能在组织重建中发挥作用；mCAFs 与免疫抑制微环境相关。空间分析表明，apCAFs 与 SELENOP 巨噬细胞在肿瘤边界和肿瘤区域共定位，iCAFs 在非恶性区域积累，mCAFs 与肿瘤细胞在非应答者区域空间关系密切。
8. 有效的化疗免疫治疗增强了 NSCLC 肿瘤微环境中 SELENOP 巨噬细胞、apCAFs 和 T 细胞之间的细胞间通讯：研究人员基于空间转录组数据分析了 SELENOP 巨噬细胞、apCAFs 和 T 细胞之间的细胞间通讯模式，发现有效免疫治疗增强了 T 细胞与这两种细胞类型的通讯。在应答者中，多种 T 细胞簇与 SELENOP 巨噬细胞和 apCAFs 通讯，信号通路也发生了显著变化，如胆固醇通路在应答者中连接了 SELENOP 巨噬细胞与其他细胞簇的信号。

研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了新辅助化疗免疫治疗后 TME 的动态变化。SELENOP 巨噬细胞在肿瘤边界和 TLSs 区域聚集，其与 apCAFs 的相互作用在成功的化疗免疫治疗诱导的抗肿瘤免疫和 TME 重建中起关键作用。CD4⁺ Treg T 细胞和 mCAFs 的分布表明存在免疫抑制性 TME，而 CD4⁺ Th17 T 细胞和 iCAFs 的积累可作为化疗免疫治疗敏感性的阳性标记。然而，该研究也存在一定局限性，如联合治疗难以区分免疫治疗和化疗各自的作用，缺乏治疗前的对照组织样本，样本量不足等。但总体而言，该研究为 NSCLC 的治疗提供了新的见解，有助于进一步优化治疗策略，提高患者的治疗效果和生存率。