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《Development and evaluation of fluorescent recombinase polymerase amplification (RPA)-based method for rapid detection of Necator americanus》一文，开发了针对美洲钩虫（Necator americanus）的荧光 RPA 检测方法。经实验验证，该方法灵敏度高、特异性强，在现场监测和早期诊断中有重要价值，为钩虫病防控提供有力技术支持。
### 1. 引言
美洲钩虫（
Necator americanus）是寄生于人体小肠的主要钩虫种类之一，在全球多个地区广泛流行，严重影响人类健康，尤其在卫生条件差的地区。传统诊断方法对低虫荷感染检测能力有限，且易受共流行寄生虫干扰，误诊风险高。分子诊断技术的发展为寄生虫检测带来新契机，重组酶聚合酶扩增（RPA）作为一种等温 DNA 扩增技术，具有快速、灵敏、便携等优势，在寄生虫检测中应用前景广阔。本研究旨在建立基于荧光 RPA 的美洲钩虫粪便样本快速检测方法，为其感染监测和预警提供技术支持。
2. 方法
2.1 伦理审批与样本采集：动物实验和人体样本研究均获相关伦理委员会批准。寄生虫样本由专业机构提供，包括多种寄生虫幼虫。人体粪便样本分别来自浙江和海南，部分样本用于评估检测方法的灵敏度和特异性，部分用于现场检测验证。
2.2 样本处理与 DNA 提取：从寄生虫幼虫直接提取基因组 DNA；粪便样本经处理后，采用特定试剂盒提取 DNA 并储存备用。
2.3 荧光 RPA 检测方法的建立
- 引物和探针设计筛选：以美洲钩虫的内部转录间隔区 2（ITS2）基因（GenBank accession no. LC036565.1）为靶基因，根据试剂盒手册设计多组荧光 RPA 引物和探针，经多轮筛选确定最佳引物组合，其扩增片段长度为 237bp。
- 反应体系优化：使用 TwistAmp exo 试剂盒，在 50μL 反应体系中，优化各反应成分浓度，确定最佳反应条件为 39°C 反应 20 分钟。
- 灵敏度和特异性评估：将美洲钩虫基因组 DNA 稀释成不同浓度进行扩增，确定检测限；同时以多种寄生虫基因组 DNA 为模板，评估方法的特异性。
2.4 对照检测方法：采用加藤厚涂片法（Kato-Katz）作为 “金标准”，对所有样本进行检测；选择半巢式 PCR（semi-nested PCR）作为对比方法，根据文献合成引物，优化反应条件并对产物进行验证。
2.5 数据统计分析：使用 SAS 9.4 软件对检测数据进行分析，计算检测方法的特异性、灵敏度、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）。
3. 结果
3.1 荧光 RPA 引物和探针筛选结果：经筛选，确定 F1-R3 引物组合为最佳，其荧光信号变化显著，能有效扩增目标片段。
3.2 实验室评估结果
- 灵敏度和特异性：该方法最低检测限为 1fg/μL，对其他寄生虫基因组 DNA 无交叉反应，特异性高。
- 粪便样本检测：对于人工制备的含不同数量美洲钩虫卵的粪便样本，荧光 RPA 检测效果优于半巢式 PCR，尤其在低感染强度样本检测中优势明显。
- 41 份粪便样本检测：与加藤厚涂片法相比，荧光 RPA 灵敏度和特异性均为 100%；与半巢式 PCR 相比，荧光 RPA 灵敏度为 100%，特异性为 91.7%。
3.3 现场样本检测结果：对 287 份现场采集的粪便样本检测发现，荧光 RPA 检测出的阳性样本数多于加藤厚涂片法和半巢式 PCR。与加藤厚涂片法相比，荧光 RPA 灵敏度为 90.0%，特异性为 91.1%；与半巢式 PCR 相比，荧光 RPA 灵敏度为 100%，特异性为 90.5%。
4. 讨论
本研究成功开发的荧光 RPA 检测方法，基于ITS2基因，以 “S” 形扩增曲线为阳性判断标准，灵敏度高、特异性强，有效检测限为 1fg/μL，显著提高了粪便样本中美洲钩虫卵的检测效率。在低感染强度样本检测中，荧光 RPA 比半巢式 PCR 更具优势。现场检测结果显示，荧光 RPA 能检测出更多阳性样本，但不同检测方法结果存在差异，可能与加藤厚涂片法的局限性、样本采集误差等有关。荧光 RPA 检测速度快，适用于资源有限地区的现场诊断，有助于早期发现和干预美洲钩虫感染，提升钩虫病监测准确性和防控效果。不过，该研究也存在局限性，如样本采集差异和 DNA 提取方法需优化等问题。
5. 结论
基于荧光 RPA 技术的美洲钩虫快速检测方法具有高灵敏度、高特异性和操作简便快速等优点，在美洲钩虫病防控和研究领域应用前景广阔，有望为基层医疗机构提供高效检测手段，助力疾病控制。
