《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Splicing correction by peptide-conjugated morpholinos as a novel treatment for late-onset Pompe disease
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本文聚焦迟发性庞贝病（LOPD），设计并评估肽偶联吗啉代寡聚物（PPMOs）。通过体外和体内实验，发现 PPMOs 能校正 LOPD 致病剪接，提高酸性 α - 葡萄糖苷酶（GAA）活性，为 LOPD 治疗提供新方向，极具研究价值。
研究背景
庞贝病（PD）根据发病年龄可分为婴儿型（IOPD）和迟发型（LOPD）。LOPD 主要由酸性 α - 葡萄糖苷酶（GAA）基因的 IVS1 点突变（c.-32-13T>G）导致剪接错误引起，该突变影响约 1:30,000 的美国人，多数 LOPD 患者为该突变的复合杂合子。正常情况下，GAA作为溶酶体糖苷水解酶，负责将糖原降解为葡萄糖，但突变导致其水平异常，使肌肉细胞内糖原积累，引发自噬缺陷和细胞死亡，进而导致患者进行性肌无力。目前，PD 的标准治疗方法是酶替代疗法，但对 LOPD 患者临床获益有限，还可能引发免疫反应。因此，开发针对 LOPD 的精准基因治疗方法迫在眉睫。
研究方法
- PPMOs 的设计与筛选：设计一系列 PPMO 化合物，其由短聚精氨酸细胞穿透肽 Ac - N - Arg6 - Gly - OH 与互补于人类GAA内含子 1 位点（靠近 IVS1 突变处）的 PMO 序列偶联而成。在患者来源的成纤维细胞中，以 20 μM 浓度通过裸核酸摄取方式筛选 PPMOs，4 天后分析细胞裂解物中溶酶体GAA酶活性。
- 细胞模型的建立与验证：将 LOPD 患者的成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC），并分化为骨骼肌细胞（myotubes）。通过免疫染色、qPCR 等方法验证 iPSC 的多能性、细胞系的正常核型和碱性磷酸酶活性，以及 myotubes 的肌源性谱系和终末分化状态。
- 动物模型的构建与表征：利用 CRISPR - CAS9 基因组工程技术，将含 IVS1 突变的人类GAA基因（包括所有 20 个内含子和外显子，共 18 kb）插入小鼠Rosa26位点，构建人源化 LOPD 小鼠模型。通过 PCR、Sanger 测序、qPCR、RNA 测序等技术对模型进行分子水平的验证和表征。
- 体内实验验证：给 LOPD 小鼠静脉注射 PPMO 化合物（如 100 mg/kg 的 RC - 3002 或不同剂量的 RC - 3003），7 天后处死小鼠，收集组织进行GAA转录本分析。通过 endpoint RT - PCR、amplicon 测序、qPCR 等方法评估 PPMOs 对GAA剪接和表达的影响，并检测血清中肝肾功能相关生物标志物。
研究结果
- PPMOs 提高患者来源成纤维细胞中GAA酶活性：筛选出能提高GAA酶活性的 PPMO 化合物，如 RC - 3001，其可使GAA酶活性较非靶向对照提高约 2.4 倍。优化 RC - 3001 序列得到 RC - 3003，用无碱基亚基替代一个鸟嘌呤残基后，显著降低细胞毒性，改善聚集情况，且保留了起始序列的全部效力。在两个患者成纤维细胞系中，RC - 3003 处理后GAA酶活性从健康对照的 8% - 10% 提高到 21% - 25%。
- LOPD 患者来源 iPSC 系模拟 LOPD 患者的剪接情况：成功将 LOPD 患者成纤维细胞重编程为 iPSC，并分化为具有正常肌源性分化特征的 myotubes。对患者 iPSC - 来源 myotubes 中GAA的剪接和表达进行分析，发现其存在与 LOPD 患者一致的错配剪接变体，且 TV2 是所有细胞系中最丰富的转录本。用 RC - 3002 处理后，qPCR 和 amplicon 测序结果表明 PPMOs 可调节GAA剪接，恢复外显子 1 - 2 连接。
- PPMO 处理纠正 LOPD 患者 iPSC - 来源 myotubes 的剪接：用 RC - 3003 处理分化的患者 iPSC - 来源 myotubes，通过 qPCR 和蛋白质印迹分析发现，正确剪接的GAA增加约 4 倍，GAA蛋白表达增加（包括 110 kDa 的初级翻译产物和 70 kDa 的翻译后修饰酶），溶酶体GAA酶活性呈剂量依赖性增加，处理后酶活性提高约 2.6 倍。
- 人源化 LOPD 小鼠模型再现致病剪接缺陷：构建的人源化 LOPD 小鼠模型，经分子水平验证，其GAA转录本表达模式与 LOPD 患者 iPSC - 来源 myotubes 相似，且准确再现了患者的错配剪接变体。该模型在 10 月龄时，肌肉组织（如股四头肌和膈肌）未出现明显形态学异常。
- PPMO 在体内增加GAA表达并纠正病理剪接：给 LOPD 小鼠静脉注射 PPMO 化合物后，endpoint RT - PCR 和 amplicon 测序显示，小鼠股四头肌中全长GAA转录本增加，剪接得到纠正。qPCR 分析表明，PPMO 处理后，骨骼肌中GAA转录本呈剂量依赖性增加，在肝脏和肾脏等非靶器官中效果较弱。同时，未发现 PPMO 处理导致的肝肾功能损伤和体重变化等不良反应。
研究结论
本研究成功设计并评估了 PPMOs 对 LOPD 的治疗效果。PPMO 化合物 RC - 3003 能有效靶向 IVS1 突变，纠正 LOPD 患者肌肉细胞中的致病剪接，提高GAA酶活性。人源化 LOPD 小鼠模型的建立为评估精准基因药物提供了有效工具，体内实验证实 PPMOs 能成功靶向并恢复GAA转录水平，且耐受性良好。虽然目前尚不清楚恢复到何种GAA酶活性水平可消除或延迟 LOPD 症状发作，但本研究为 LOPD 的治疗提供了新的策略和方向，有望为患者带来更有效的治疗方法。
