基于长偏移配对切口的高效精准体内靶向插入策略：基因治疗新希望

为解决在体细胞中高效精准整合大 DNA 片段且避免产生不可预测产物的难题，研究人员开展了长偏移配对切口靶向整合（LOTI）策略的研究。结果显示，LOTI 能提高敲入效率、降低脱靶效应，还在血友病 B 小鼠模型中恢复了 55% FIX 活性，为体内基因整合提供新策略。

　　长偏移配对切口靶向整合（LOTI）策略是成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）切口酶靶向整合技术的重大进展，技术成熟度（TRL）达 5 - 6 级，已在相关环境中验证，并在疾病模型中初步证实概念。LOTI 利用 Cas9 切口酶（Cas9n）在基因组位点和供体模板上引入长偏移配对切口（间隔≥200 个碱基对），提高体细胞的敲入效率，同时将脱靶效应和靶向插入缺失（indels）降至最低。研究通过单剂量质粒给药，恢复了血友病 B 小鼠 55% 的 FIX 活性，展现出临床潜力。不过，该研究主要采用流体动力学方法将 DNA 输送到肝脏，无法直接用于人类治疗。未来可使用肝脏特异性靶向脂质纳米颗粒或病毒来输送 LOTI 元件，用于 FIX 疾病的临床治疗。此外，LOTI 的发展凸显了政策支持基因编辑技术临床转化的必要性，包括资金、安全指南和试验监管框架等。总之，LOTI 是一种前景广阔的基因编辑策略，有望进一步发展并实现临床转化。LOTI 策略增强了 CRISPR - 切口酶介导的体细胞 DNA 整合，提高敲入效率，限制随机转基因插入和脱靶插入缺失形成，其修复机制涉及 Rad51、Rad52 和连接酶 I/III。基于 CRISPR 的 DNA 片段靶向插入在基因治疗领域前景光明，但在体细胞中高效精准整合大 DNA 片段并避免不可预测产物仍是难题。LOTI 策略增强了 Cas9n 的靶向基因整合能力，在肝细胞中实现至少 1.5kb 基因片段的高效敲入，相比基于 Cas9 的策略，LOTI 降低脱靶活性，限制靶位点有害插入缺失的形成，为体内体细胞基因整合提供了精准高效的策略。