L - 天冬酰胺酶激活 PAR2 新机制：解锁急性淋巴细胞白血病治疗密码

急性淋巴细胞白血病（ALL）严重威胁生命，L - 天冬酰胺酶治疗 ALL 的机制尚不明晰，尤其是其激活蛋白酶激活受体 2（PAR2）的方式。研究人员通过多种实验技术，发现 L - 天冬酰胺酶可切割 PAR2 的 N30-R31和 R31-S32位点，暴露拴系配体，引发细胞内 Ca2+失衡，诱导 ALL 细胞凋亡，为 ALL 治疗提供新方向。

　　在医学的抗癌战场上，急性淋巴细胞白血病（ALL）是一个可怕的 “敌人”，它主要发生在骨髓和血液中，是儿童群体里最常见的癌症，也是导致儿童因癌症死亡的首要原因。自 20 世纪 60 年代末起，L - 天冬酰胺酶作为一种化疗药物被用于 ALL 的治疗，它能激活细胞内的固有凋亡途径来杀死 ALL 细胞，主要过程是通过诱导 IP₃受体（IP₃R）介导的内质网（ER）Ca²⁺释放，打破细胞内 Ca²⁺平衡，进而激活 Ca²⁺介导的 calpain-1-Bid-caspase-3/12 凋亡通路 。然而，L - 天冬酰胺酶激活 PAR2 的具体分子机制却一直是个谜，这就像一把锁，等待着研究人员去找到开启它的钥匙。

为了攻克这个难题，来自加拿大卡尔加里大学（Arnie Charbonneau Cancer and Alberta Children’s Hospital Research Institutes 等多个部门）以及中国宁波大学附属第一医院的研究人员携手展开研究。他们的研究成果发表在《Cell Death Discovery》杂志上，为解开这一谜团带来了曙光。

研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞层面，利用单细胞 Ca²⁺成像技术，实时监测细胞内 Ca²⁺浓度的变化；采用基因敲低策略，敲低 μ- 阿片受体 1（μ-OR1），以排除其对实验结果的干扰，更精准地研究 PAR2 相关的信号通路。在蛋白质分析方面，通过合成 PAR2 N 端肽段并进行 L - 天冬酰胺酶切割实验，结合液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）分析，精确鉴定 L - 天冬酰胺酶在 PAR2 上的切割位点。此外，还运用了时间推移共聚焦显微镜和纳米荧光素酶（Nluc）报告释放实验，直观地观察和分析 L - 天冬酰胺酶对 PAR2 的作用。

研究结果如下：

• L - 天冬酰胺酶作用于 PAR2 的 N 端胞外区域：弹性蛋白酶能够通过切割 PAR2 拴系配体（TL）下游的 S₆₇-V₆₈残基，解除胰蛋白酶介导的 PAR2 激活。研究人员以此为切入点，用弹性蛋白酶预处理 SEM ALL 细胞，再加入 L - 天冬酰胺酶，发现弹性蛋白酶抑制了 L - 天冬酰胺酶诱导的 ER Ca²⁺释放，这表明 L - 天冬酰胺酶可能通过作用于含 TL 的 PAR2 N 端胞外区域来引发 ER Ca²⁺释放。同时，研究人员使用催化失活形式的 L - 天冬酰胺酶（T₁₁₁V/K₁₈₄T 或 D₁₁₂T/K₁₈₄T）处理 μ-OR1 敲低的 ALL 细胞，发现这些失活形式的酶无法诱导 ER Ca²⁺释放，这意味着 L - 天冬酰胺酶刺激 PAR2 介导的 ER Ca²⁺释放需要其酶活性。
• L - 天冬酰胺酶切割 PAR2 N 端胞外区域：研究人员通过对稳定转染 pcDNA3.1 (+) 构建体（携带单体红色荧光蛋白（mRFP）-PAR2 - 增强型黄色荧光蛋白（eYFP））的 HEK293T 细胞进行时间推移共聚焦显微镜 N 端 mRFP 释放测定，发现 L - 天冬酰胺酶随着时间推移会降低细胞周边的 mRFP 信号，而 C 端报告基因 eYFP 信号不变，这直观地显示了 L - 天冬酰胺酶对 PAR2 N 端胞外区域的切割作用。同时，在表达 Nluc-PAR2-eYFP 的 CHO-K1 细胞中进行 Nluc 释放测定，结果显示 L - 天冬酰胺酶能触发剂量依赖性的发光增加，进一步证实了 L - 天冬酰胺酶会切割 PAR2 N 端胞外区域。
• L - 天冬酰胺酶切割 PAR2 特定残基：为了确定 L - 天冬酰胺酶在 PAR2 N 端胞外区域的切割位点，研究人员合成了包含潜在切割位点的 PAR2 T₂₅-T₄₅肽段，分别用 L - 天冬酰胺酶和胰蛋白酶处理，再进行 LC-MS/MS 分析。结果发现，L - 天冬酰胺酶切割 PAR2 N 端胞外区域的两个位点：N₃₀-R₃₁和 R₃₁-S₃₂，且这两个位点都位于 TL 的上游。研究人员还设计了基于荧光共振能量转移（FRET）的 L - 天冬酰胺酶切割实验，用野生型、N₃₀G、R₃₁G 和 N₃₀G/R₃₁G 取代形式的 DABCYL-PAR2 T₂₅-T₄₅-EDANS 进行实验，结果验证了 L - 天冬酰胺酶确实切割 N₃₀-R₃₁和 R₃₁-S₃₂残基。此外，研究还发现 R₃₁G 取代的肽段对 L - 天冬酰胺酶介导的 EDANS 荧光增加的抑制作用更强，表明 R₃₁是 L - 天冬酰胺酶的首选靶点。
• 新扩展的 TL 肽引发 ER Ca²⁺释放：由于 L - 天冬酰胺酶切割 PAR2 N 端产生了新扩展的 TL 肽，研究人员合成了这些新扩展的 TL 肽（R₃₁SSKGRSLIGKV₄₂和 S₃₂SKGRSLIGKV₄₂），并在 μ-OR1 敲低的 SEM ALL 细胞中进行实验。结果显示，这些新扩展的 TL 肽能够引发 ER Ca²⁺释放，而对照肽则不能，这表明 L - 天冬酰胺酶驱动的 PAR2 依赖性 ER Ca²⁺释放是由于新扩展的 TL 暴露所致。

研究结论和讨论部分指出，本研究首次揭示了 L - 天冬酰胺酶激活 PAR2 的分子机制，即通过切割 N₃₀-R₃₁和 R₃₁-S₃₂残基，暴露新扩展的 TL，进而引发 IP₃R 介导的 ER Ca²⁺释放，最终导致 ALL 细胞凋亡。这一发现为理解 L - 天冬酰胺酶治疗 ALL 的作用机制提供了关键线索，建立了其 β- 天冬氨酰肽酶活性与通过刺激 PAR2 调节细胞内 Ca²⁺稳态之间的联系，为开发更有效的 ALL 治疗策略奠定了理论基础，有望推动 ALL 治疗领域的进一步发展 。