ARHGAP12通过调控上皮紧密连接力学特性与旁细胞渗漏通路通透性抑制F-肌动蛋白组装

《Cell Reports》：ARHGAP12 suppresses F-actin assembly to control epithelial tight junction mechanics and paracellular leak pathway permeability

本研究发现ARHGAP12通过ZO-2招募至紧密连接（TJ），其串联WW结构域（tWW）以多价方式结合N-WASP的PRD结构域，抑制N-WASP寡聚化和F-肌动蛋白（F-actin）组装。该机制通过调节连接张力，特异性控制大分子旁细胞转运（leak pathway）而不影响离子通道（pore pathway），为上皮屏障功能调控提供了新靶点。

　　研究背景
紧密连接（TJ）作为上皮组织的关键结构，通过调控旁细胞转运维持机体稳态。近年研究发现TJ存在两条独立通路：由claudin家族介导的离子通道（pore pathway）和调控大分子转运的渗漏通路（leak pathway）。然而，渗漏通路的分子调控机制尚不明确。机械力敏感蛋白ZO家族通过连接细胞骨架与TJ，在维持屏障功能中发挥核心作用。

主要发现

1. ARHGAP12的定位机制
   研究首次证实RhoGAP蛋白ARHGAP12通过其SH3结构域与ZO-2的PSTPIPP基序结合，被特异性招募至TJ。免疫共沉淀实验显示，ARHGAP12的串联WW结构域（tWW）还能与ZO-1相互作用，形成稳定的TJ复合体。基因敲除实验证实，ZO-1/ZO-2双敲除细胞中ARHGAP12的TJ定位显著降低。

2. 多价相互作用机制
   通过AlphaFold结构预测结合ITC实验，发现ARHGAP12的tWW结构域通过WW2亚基的Y129和W140残基，特异性识别N-WASP PRD结构域中的5个保守PPxR重复序列。这种多价相互作用呈现梯度结合特性：N端NP1/2/3肽段结合力（K_d≈14μM）显著强于C端NP3/4/5肽段（K_d≈35μM）。关键的是，PPxR基序中的精氨酸突变（R/A）完全破坏了这种相互作用。

3. 功能调控机制
   TIRFM实验揭示，tWW结构域虽不改变N-WASP L235P突变体诱导的Arp2/3复合体激活，但显著降低F-actin簇中心的荧光强度。这表明ARHGAP12通过空间位阻抑制N-WASP寡聚化，而非直接阻断其催化活性。在MDCK细胞模型中，ARHGAP12缺失导致连接张力增加，同时大分子通透性降低，但对离子转运无影响。

研究意义
该研究阐明了上皮细胞通过ARHGAP12-ZO-N-WASP轴精细调控TJ力学特性的分子机制：①首次发现WW结构域介导的多价相互作用可调控细胞连接处actin动力学；②揭示渗漏通路与pore pathway的独立调控机制；③为炎症性肠病等上皮屏障功能障碍疾病提供潜在治疗靶点。特别值得注意的是，该机制通过平衡branched F-actin网络张力，实现对大分子转运的"微调"控制，这一发现革新了人们对TJ动态调控的认知。