盘尾丝虫多形性肿瘤的空间蛋白质组学：揭示蛋白质表达的局部与全身失调

《PLOS Pathogens》：Spatial proteomics of Onchocerca volvulus with pleomorphic neoplasms shows local and systemic dysregulation of protein expression

本文利用激光捕获显微切割（LCM）结合高灵敏度质谱分析，研究盘尾丝虫（Onchocerca volvulus）多形性肿瘤（PN）的蛋白质组。发现 PN 的蛋白质组与健康虫体胚胎相似，且 PN 会导致虫体全身蛋白质表达失调，还识别出与肿瘤相关的蛋白质，为研究盘尾丝虫病提供新视角。

　　### 研究背景
盘尾丝虫（Onchocerca volvulus）是引发盘尾丝虫病（又称河盲症）的丝状线虫寄生虫，全球超 2.2 亿人生活在该病传播风险区，主要集中在撒哈拉以南非洲。目前尚无能有效杀死所有成虫的药物用于大规模药物治疗（MDA），伊维菌素（ivermectin）是消除盘尾丝虫病的主要药物，虽能杀死微丝蚴，重复给药对成虫也有一定作用，但部分成年雌性盘尾丝虫会发展出多形性肿瘤（PN），且伊维菌素治疗后其发生率升高，可达 10%。此前研究因动物模型有限、样本采集困难，对 PN 的详细起源和蛋白质组成了解不足。随着蛋白质组分析技术和基因组信息的发展，对盘尾丝虫进行可视化蛋白质组学研究成为可能。

材料和方法

1. 伦理声明：临床试验方案经加纳健康与联合科学大学、加纳卫生服务机构、加纳食品药品管理局、美国凯斯西储大学和华盛顿大学医学院伦理审查委员会批准（IRB ID: 201910085）。使用去标识化的结节切片进行分析不被视为人体研究。
2. 结节样本制备：盘尾丝虫结节来自一项对比伊维菌素、二乙碳酰氨嗪和阿苯达唑（IDA）与伊维菌素加阿苯达唑治疗盘尾丝虫病的临床试验。选取含单个 “活” 雌性虫体的结节（3 个有 PN，3 个健康对照，HC），对虫体的体壁、肠道、子宫和 PN 组织或胚胎等 4 个区域进行激光捕获显微切割（LCM）。
3. 样本制备用于 LC-MS/MS 分析：收集的 LCM 细胞经裂解、还原、烷基化、酶解等处理，所得肽段用 C18 固相萃取柱脱盐，再用液相色谱 - 质谱联用仪（LC-MS/MS）分析。数据通过 Mascot 软件搜索数据库，并经 Scaffold 软件验证。
4. 蛋白质功能注释和图形可视化：通过序列搜索去除与宿主或其他物种匹配的肽段，使用多种工具对盘尾丝虫和沃尔巴克氏体（Wolbachia）蛋白质进行功能注释和富集分析，用归一化光谱丰度因子（NSAFs）比较蛋白质丰度。
5. 蛋白质和抗体生产：选取 OVOC8391 基因片段进行 PCR 扩增、克隆和表达，制备重组蛋白并免疫小鼠获得抗体。
6. 免疫组织化学定位：对石蜡包埋的结节切片进行免疫组织化学染色，观察 OVOC8391-1 蛋白在盘尾丝虫体内的定位。

结果

1. 形态学描述：健康雌性盘尾丝虫器官界限清晰，胚胎发育正常；PN 雌性盘尾丝虫有细胞侵入假体腔，细胞质 / 细胞核比例高，部分子宫分支因 PN 细胞侵袭难以识别，PN 组织对 H&E 染色亲和力高，表明其 DNA 含量高，细胞分裂迅速。
2. 蛋白质检测：共鉴定出 3150 种真核生物蛋白质和 165 种Wolbachia蛋白质。在 PN 组织中检测到 1390 种盘尾丝虫来源的蛋白质，其中 594 种在 HC 虫体组织中未检测到。HC 虫体胚胎组织有 574 种独特蛋白质，且有 109 种在 PN 虫体中未检测到。
3. 组织面积与光谱计数相关性：分析发现，不同组织的解剖面积与光谱计数或总蛋白数量的变化不完全相关。如 PN 组织和 HC 胚胎组织分析面积相似，但 PN 组织蛋白质数量是 HC 胚胎组织的两倍，光谱计数却只有其 42%。
4. 与肿瘤相关的蛋白质：通过比较 PN 与其他组织的蛋白质特征，发现 PN 组织中参与蛋白质合成、降解等过程的蛋白质富集。KEGG 通路分析显示，核糖体、柠檬酸循环等通路显著富集；InterPro 分析发现核苷酸结合等结构域富集；GO 分析表明细胞内解剖结构、细胞质等相关术语显著富集。
5. 免疫定位：免疫组织化学定位证实，OVOC8391（OvDig-1）在 HC 虫体的多种组织和 PN 虫体的体壁、PN 组织中表达，且在不同细胞类型中的表达存在差异。
6. Wolbachia 衍生蛋白质：在 PN 虫体和 HC 虫体中均检测到少量Wolbachia蛋白质，其在 PN 虫体的体壁和 PN 组织中分布不同。

讨论

1. 蛋白质组分析意义：本研究首次对患有 PN 的盘尾丝虫进行蛋白质组分析，证实 PN 由丝虫组织引起，且发现了一些在 PN 组织中特有的蛋白质，可能作为潜在生物标志物。
2. 蛋白质表达与肿瘤发展：PN 组织的蛋白质组与 HC 虫体胚胎组织相似，且参与蛋白质生产和降解的途径富集，表明 PN 是一种失调组织，其发展可能与蛋白质表达调控异常有关。
3. 全身影响：虽然 PN 主要出现在特定部位，但蛋白质组分析显示，其对整个虫体产生影响，导致全身蛋白质表达失调，类似哺乳动物早期肿瘤转移的现象。
4. Wolbachia 的作用：在 PN 细胞中检测到少量Wolbachia蛋白质，其来源和作用有待进一步研究。
5. 技术局限性：LCM 结合 LC-MS/MS 技术虽能有效分析组织蛋白质，但存在检测蛋白质翻译后修饰灵敏度有限、数据定量和归一化困难等问题。

结论

LCM 结合 LC/MS 技术可在微观层面评估盘尾丝虫的蛋白质组。PN 具有多样的蛋白质组，与 HC 虫体胚胎相似，且 PN 的存在会导致虫体全身蛋白质表达失调，还鉴定出与哺乳动物癌症相关的 PN 组织特异性蛋白质，为盘尾丝虫病的研究提供了新的方向和依据。