炭疽芽孢杆菌生物变种蜡样芽孢杆菌致兔吸入性炭疽样疾病及医学应对策略的研究

《PLOS Pathogens》：Bacillus cereus biovar anthracis causes inhalational anthrax-like disease in rabbits that is treatable with medical countermeasures

推荐阅读：本文利用新西兰白兔（NZW）吸入模型，研究炭疽芽孢杆菌生物变种蜡样芽孢杆菌（Bcbva）的致病性及医学应对措施（MCM）疗效。发现 Bcbva 感染类似炭疽芽孢杆菌，且疫苗和抗生素治疗有效，为 Bcbva 研究及治疗提供重要参考。

　　### 引言
炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）是炭疽病的病原体，虽对全球人类健康影响有限，但因历史事件被视为生物威胁 agent 。蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）生物变种炭疽杆菌（Bcbva）含有类似炭疽芽孢杆菌的毒力质粒，能引起炭疽样疾病，已被美国疾病控制与预防中心（CDC）列为选择 agent 。此前研究测定了 Bcbva 在小鼠和豚鼠中的皮下及鼻内致死剂量，本研究则利用兔吸入性炭疽模型，评估 Bcbva 感染的致死性、疾病进展，以及 MCM 对 Bcbva 气溶胶暴露的疗效。

方法

1. 伦理声明：所有研究严格遵循动物福利相关法规，经机构动物护理和使用委员会批准，在符合标准的实验室环境中开展。
2. 细菌菌株和生长条件：Bcbva 菌株 CA 和 CI 在生物安全 3 级（BSL - 3）实验室培养，使用特定培养基和条件诱导毒素和荚膜表达，制备用于挑战研究的孢子时，经过多步处理并进行质量控制。
3. 聚合酶链反应（PCR）表征：通过 PCR 扩增特定基因，确认菌株身份和毒力质粒的存在。
4. 动物吸入挑战系统：构建鼻吸入测试系统，使用 3 - 喷射碰撞雾化器产生气溶胶，测定气溶胶颗粒大小和吸入剂量。
5. 动物和温度监测：选用新西兰白兔（NZW），植入数字转发器监测体温，定义多种体温相关指标用于分析感染情况。
6. 吸入毒力测定：设置不同剂量组，让兔子吸入 Bcbva 孢子，监测感染症状，计算半数吸入感染剂量（INHID₅₀）和半数吸入致死剂量（INHLD₅₀）。
7. 生物样本采集：在感染前后不同时间采集血液、血清等样本，对组织样本进行处理，用于细菌计数和毒力因子分析。
8. 毒力因子表达和抗体反应检测：采用 ELISA 试剂盒检测血清中保护性抗原（PA）、可溶性透明质酸（HA）和可溶性聚 - D - 谷氨酸（PDGA）的含量，评估毒力因子表达和抗体反应。
9. MCM 疗效评估：设置多个动物组，分别接受不同的 MCM 处理，包括预暴露接种炭疽疫苗吸附剂（AVA）、暴露后用左氧氟沙星（PEP）单药或联合 AVA 治疗，监测动物存活情况和感染症状。
10. 统计分析：运用多种统计方法，对数据进行分析，确定剂量、性别等因素对感染结果的影响。

结果

1. Bcbva 孢子气溶胶特性：使用梯度纯化的 Bcbva 孢子产生了可重复、一致的气溶胶，其质量中位空气动力学直径（MMAD）和几何标准偏差（GSD）稳定。
2. Bcbva CA 和 CI 吸入 ID₅₀和 LD₅₀估计：通过监测兔子体温，以显著体温升高（SIBT）和死亡为指标，计算出 Bcbva CA 和 CI 的 INHLD₅₀，数值与炭疽芽孢杆菌相近。
3. 疾病进展特征：气溶胶暴露 Bcbva 孢子后，兔子出现不同的体温反应模式，多数在 2 - 5 天死亡，感染动物的组织和血液中可检测到高浓度细菌。
4. Bcbva 体内毒力因子表达特征：Bcbva 在感染过程中呈现不同的菌落形态，血清中可检测到毒力因子，且体内表达水平高于体外培养。
5. MCM 疗效和疾病表现评估：所有治疗方案对 Bcbva 感染均有一定效果，但 PEP 左氧氟沙星单药治疗停药后多数动物死亡，AVA 联合治疗或预暴露接种 AVA 可使动物存活。
6. 毒力因子检测和免疫反应：未治疗和 PEP 左氧氟沙星单药治疗后死亡的动物血清中可检测到 HA 和 PA，AVA 治疗的动物则检测不到；部分治疗动物出现血清抗 PA83 IgG 血清转化。

讨论

本研究表明 Bcbva 引起的炭疽样感染在多个方面与炭疽芽孢杆菌相似，但在疾病进展上存在差异，如剂量依赖性的 SIBT 和死亡时间、多变的菌落形态等。MCM 研究显示，AVA 联合治疗或预暴露接种 AVA 对 Bcbva 感染有效，为临床治疗提供了重要依据。同时，研究也指出 Bcbva 感染的诊断可能存在困难，需要更精准的诊断方法。