《CHINESE MEDICAL JOURNAL》：Extracellular vesicles: Roles in oocytes and emerging therapeutic opportunities
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本文聚焦细胞外囊泡（EVs）在卵母细胞中的作用。它在生理状态下参与卵母细胞生殖过程的调控，病理状态时却影响卵母细胞质量。同时，EVs 具有治疗卵巢疾病的潜力。这篇综述为深入了解其机制及临床应用提供参考。
细胞外囊泡在卵母细胞生理过程中的重要角色
在女性生殖系统中，功能性卵母细胞的产生是生育的关键。而细胞外囊泡（EVs）作为细胞间通信的重要媒介，在卵母细胞的生殖过程里发挥着不可或缺的作用。
卵母细胞的生长发育依赖于其所处的微环境，这个微环境由卵泡膜细胞、颗粒细胞（GCs）以及充满卵泡液的卵泡腔构成。EVs 就像忙碌的 “小邮差”，穿梭于这些细胞之间，传递着各种生物活性分子。根据生成方式，EVs 主要分为两类：一类是通过内体胞吐形成的外泌体，另一类是从细胞膜直接出芽产生的微囊泡。这些小小的囊泡里包裹着核酸、蛋白质、脂质和代谢物等 “秘密信件”，在细胞间的局部或全身运输中发挥作用。
研究发现，卵泡液中的 EVs 携带的货物与卵母细胞质量密切相关。比如，分析人类和其他哺乳动物卵泡液中外泌体的微小 RNA（miRNA）谱，发现其涉及多个关键通路。像泛素介导的信号通路能调节卵母细胞减数分裂的恢复；WNT 蛋白在卵泡发育和黄体化的特定阶段表达；丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路促进颗粒细胞增殖和卵丘扩张；转化生长因子 -β（TGF-β）家族成员则对卵丘细胞中 MAPK 信号通路的激活有促进作用。不仅如此，还有研究表明，卵泡液 EVs 中的脂质成分、线粒体电子传递链基因的 mRNA 水平等都能反映卵母细胞的质量。
除了这些观察性研究，实验证据也不断涌现。体外研究发现，卵泡液来源的 EVs 可以被卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞摄取。比如，颗粒细胞分泌的外泌体中的 miR-148a-3p，能通过靶向一个激活 Rho GTP 酶的鸟氨酸核苷酸交换因子，提高猪卵母细胞的抗氧化能力，这对卵母细胞后期的成熟至关重要。还有，外泌体中的 miR-31-5p 可以通过 WNT/β-CATENIN 通路促进猪颗粒细胞中孕酮的合成，而 miR-21-5p 则能激活胰岛素受体底物 1 / 蛋白激酶 B（AKT）信号通路，改善颗粒细胞对葡萄糖的摄取，为卵母细胞发育和卵泡生成提供充足的能量。
在卵泡发育的不同阶段，EVs 也发挥着动态协调的作用。从优势卵泡的分化，到排卵前的准备，再到受精过程，都有 EVs 的身影。例如，牛卵泡液分析显示，小的从属卵泡的 EVs 富含甘油磷脂和鞘脂，而大的优势卵泡的 EVs 则富含溶血磷脂，这些不同的脂质成分参与了与卵母细胞能力和排卵前卵泡发育相关的过程。在排卵前，猪卵泡液外泌体将 miR-10b-5p 传递给颗粒细胞，促进趋化因子分泌，有助于免疫细胞募集和排卵。在受精时，精子会获取卵丘细胞释放的含有 CD81 的囊泡，而卵母细胞释放的 CD9 则以 Exosome 的形式转移到精子上，对膜融合至关重要。
病理状态下细胞外囊泡对卵母细胞质量的不良影响
然而，当卵巢出现病理状况时，卵母细胞与周围体细胞之间正常的细胞间通信就会被打乱，EVs 也会 “变质”，成为影响卵母细胞质量和卵泡健康的 “坏分子”。
以多囊卵巢综合征（PCOS）为例，患者的卵母细胞质量往往较差，这与卵泡发生过程中的信号紊乱有关。研究发现，PCOS 患者卵泡液中的 EVs 会导致小鼠卵母细胞线粒体分布和纺锤体功能异常。具体来看，PCOS 患者卵泡液外泌体中 circular_0008285 表达下调，它原本像 “海绵” 一样吸附 miR-4644，miR-4644 会抑制低密度脂蛋白受体，干扰颗粒细胞中的胆固醇运输，进而影响类固醇生成。同时，卵泡液外泌体中上调的 miR-143-3p 会加速颗粒细胞凋亡，还抑制己糖激酶 2，拮抗颗粒细胞的糖酵解，影响卵母细胞成熟和卵泡生成所需的能量供应。此外，miR-34a-5p 也会干扰颗粒细胞葡萄糖代谢，导致细胞凋亡，而 S100 钙结合蛋白 A9 则会激活核因子 κB（NF-κB）信号通路，加剧卵泡内的炎症反应。
卵巢衰老也是影响女性生育的重要因素。随着年龄增长，卵泡液 EVs 中的 miRNA 谱会发生变化。例如，上调的 miR-134 可能靶向 BCL2，这是一种已知的凋亡抑制因子；而下调的 miR-21-5p 则可能影响 p53 和 TGF-β 通路，导致卵泡生成缺陷。而且，卵泡液 EVs 中孕酮及其受体水平也会降低，这可能与受精能力下降有关，不过目前这些研究大多是观察性的，还需要更多实验来验证。
子宫内膜异位症同样会对卵母细胞造成损害。异位的子宫内膜细胞会引发盆腔粘连和慢性炎症，还会导致铁过载。铁过载时，颗粒细胞会释放异常的外泌体给卵母细胞，干扰钙、MAPK、细胞周期调控、卵母细胞减数分裂和铁死亡等关键信号通路，阻碍卵母细胞成熟。同时，患者卵泡液外泌体中 miR-122-5p 过表达，会抑制葡萄糖代谢中的关键酶醛缩酶 A，导致卵母细胞能量供应不足，质量下降。
原发性卵巢功能不全（POI）和早发性卵巢功能衰竭（POF）虽然临床定义不同，但都表现为卵泡储备减少和功能性卵母细胞显著减少。在 POI 小鼠模型中，卵巢组织中外泌体 miR-122-5p 水平显著升高，会促进颗粒细胞凋亡。POF 患者血浆外泌体中，一些 miRNA 会抑制卵母细胞减数分裂和细胞增殖相关通路，比如上调的 miR-19b-3p 会抑制卵母细胞成熟关键的骨形态发生蛋白受体 2 的转录活性，而 POF 兔子血浆外泌体中高表达的 miR-10a-5p 会抑制颗粒细胞中的 AKT / 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，导致细胞凋亡增加。
环境相关的不孕症也不容忽视。工农业中广泛使用的合成化学物质，如内分泌干扰化学物质（EDCs），会干扰激素稳态。像邻苯二甲酸酯会使女性卵泡液中 miR-116-5p 上调，通过靶向抗氧化应激的关键因子叉头框 O3a，损害卵母细胞成熟；双酚 A 则会导致卵泡液中 EVs 的 miR-27b-3p 下调，促进颗粒细胞凋亡，进而影响卵母细胞质量。
总体而言，病理状态下 EVs 的内容物发生改变，影响卵母细胞质量和卵泡健康，但目前很多异常分子的病理影响还未得到实验证实，而且研究大多集中在卵泡液来源的 EVs，还需要探索更有效的分离和鉴定方法。
细胞外囊泡在卵巢疾病治疗中的潜力
尽管细胞外囊泡在病理状态下会 “捣乱”，但它独特的性质却使其成为治疗卵巢疾病的 “潜力股”。EVs 的双层膜结构和表面电荷赋予其运输生物活性货物时的稳定性，而且它来源于哺乳动物细胞，具有生物相容性，甚至可以从患者自身获取，免疫原性低。在一些疾病的临床试验中，EVs 已经展现出良好的效果。
在改善卵母细胞质量方面，研究发现人脐带间充质干细胞来源的外泌体（hucMSCs-Exos）可以积累在原始卵母细胞中，携带 miR-146a-5p 和 miR-21-5p 等功能分子，上调磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）/mTOR 信号通路，激活原始卵泡。在老年小鼠中，卵巢内注射这些治疗性外泌体可以降低活性氧水平，减少纺锤体形态异常的卵母细胞比例，在体外成熟的老年卵母细胞中也观察到了类似的效果。此外，治疗性 EVs 还能改善卵母细胞线粒体功能，比如人羊膜间充质干细胞来源的外泌体中的 miR-320a，抑制卵母细胞中病理性升高的 Sirtuin 信号通路，其下游靶蛋白参与线粒体融合。而且，卵泡液 EVs 中的一些结构和功能蛋白，如肌动蛋白相关蛋白 2/3 复合物、肌球蛋白和 F - 肌动蛋白等，有助于卵母细胞纺锤体的稳定，对辅助生殖技术中未成熟卵母细胞的玻璃化冷冻复苏有重要意义。
颗粒细胞对卵母细胞的发育至关重要，它能弥补卵母细胞某些代谢过程的不足，还能塑造激素微环境。一些治疗性 EVs 可以保护颗粒细胞。例如，骨髓间充质干细胞来源的外泌体（BMSCs-Exos）中的 miR-144-5p，靶向磷酸酶和张力蛋白同源物，激活 AKT，减轻化疗诱导的卵巢衰竭。月经血来源的间充质干细胞分泌的外泌体中的血小板反应蛋白 - 1，通过上调 SMAD/PI3K/AKT/p53 信号通路，抑制颗粒细胞凋亡。BMSCs-Exos 中的 miR-664-5p 可以直接结合 p53 mRNA 的 3′非翻译区（3′-UTR），保护颗粒细胞免受顺铂诱导的凋亡。同时，hucMSCs-Exos 中的 miR-22-3p 可以抑制激活转录因子 4 / 激活转录因子 3/C/EBP 同源蛋白（ATF4/ATF3/CHOP）信号通路，减轻 POF 模型中颗粒细胞的凋亡。BMSCs-Exos 中的 miR-21-5p 还能激活 Notch 信号通路，改善卵巢功能，并且调节激素合成，促进雌激素分泌。此外，治疗性 EVs 还能抑制颗粒细胞的炎症反应，如 hucMSCs-Exos 抑制 PCOS 患者颗粒细胞中 NF-κB 通路，减少炎症因子表达；BMSCs-Exos 抑制自身免疫性 POI 患者颗粒细胞中 NF-κB 通路和 NOD 样受体蛋白 3 介导的细胞焦亡通路。
卵巢的血管网络对卵母细胞发育至关重要，它负责输送氧气、促性腺激素和类固醇前体等营养物质。在 POF 和 POI 等疾病中，血管生成通路下调，血管稳定性下降。hucMSCs-Exos 携带的 miR-126-3p 可以激活 PI3K/AKT/mTOR 信号通路，上调血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子 - 1 和血管生成素等血管生成相关细胞因子，改善血管生成。在化疗诱导的 POF 模型中，间充质干细胞来源的 EVs（MSCs-EVs）可以使 α-SMA 阳性细胞分布正常化，恢复卵泡的血液供应。而在子宫内膜异位症和 PCOS 中，血管生成异常活跃，需要抑制。例如，添加 M1 巨噬细胞来源的纳米囊泡可以将 M2 巨噬细胞重编程为 M1 巨噬细胞，减少血管生成；月经血来源的间充质干细胞分泌的外泌体可以降低子宫内膜异位症细胞中 VEGF 的表达；BMSCs-Exos 可以减少 PCOS 小鼠模型中病理血管形成和维持的关键调节因子血小板内皮细胞粘附分子 - 1 的内皮表达，但调节血管生成的具体 EV 成分还需进一步研究。
卵巢纤维化近年来受到越来越多的关注，它会限制卵泡生长和排卵。治疗性 EVs 可以针对纤维化的关键因素发挥作用。例如，羊水来源的外泌体激活 SMAD-6，抑制 TGF-β 信号通路，降低 POI 大鼠卵巢的胶原蛋白密度；在子宫内膜异位症中，miR-214 可以抑制结缔组织生长因子（CTGF）的表达，转染 miR-214 的子宫内膜基质细胞分泌的外泌体可以减轻小鼠的纤维化进展。
不过，EVs 在实际应用中还面临一些挑战，比如卵巢靶向性不足和局部滞留性差。目前，基因工程是增强 EVs 靶向能力的主要策略之一，还可以通过探索有效的给药方法，如结合生物材料，提高 EVs 的治疗效果。
研究总结与展望
自 20 世纪 80 年代关于 EVs 的第一篇论文发表以来，这一领域迅速发展。目前，对 EVs 在卵母细胞中作用的研究已经从描述性研究向实验验证转变，更加关注其包裹的分子介质及其功能的实验证据，这有助于深入理解产生高能力卵母细胞的细胞间通信机制。虽然 EVs 在治疗卵巢疾病方面展现出潜力，但目前其应用仍局限于动物模型和早期临床试验。未来，持续深入研究工程化的 EVs，有望加速其从实验室到临床的转化，为改善女性生殖健康带来新的希望。
