血浆中基于正义 - 反义双小沟结合探针 PCR 检测技术用于结直肠癌早期检测的研究突破

《CHINESE MEDICAL JOURNAL》：Development of a sense-antisense and dual-minor groove binder probe PCR assay in plasma for early detection of colorectal cancer

为解决血液甲基化检测面临的如 cfDNA 浓度低等问题，来自郑州大学第一附属医院的研究人员开展了结直肠癌（CRC）血液甲基化检测相关研究。他们筛选出潜在标记物并采用 SADMP 技术，结果显示双靶点检测灵敏度和特异性良好，有望成为 CRC 非侵入性筛查新工具。

　　向编辑：自 Cologuard 推出以来，基于粪便 DNA 甲基化的结直肠癌（CRC）筛查方法受到越来越多关注。与基于粪便的检测相比，基于血细胞游离 DNA（cfDNA）甲基化的检测可能更容易被接受且更适合临床应用，但目前应用并不广泛。Septin9 曾是一种有前景的检测方法，但因其早期灵敏度不足，现在美国胃肠病学会（ACG）指南已不推荐使用。血液甲基化检测的发展面临诸多挑战，包括 cfDNA 浓度低、组织溯源问题和白细胞干扰等。解决这些问题的一个潜在方法是识别更有前景的标记物，同时改进能检测少量 cfDNA 的灵敏检测技术也至关重要。

在本研究中，研究人员通过 17 个公开的 450K/850K 微阵列数据集分三步确定了结直肠癌早期甲基化标记物。第一步，从 14 个基因表达综合数据库（GEO）数据集中识别差异甲基化的 CpG（DMC）位点，这些数据集包含结直肠癌、腺瘤和正常相邻组织（NAT）样本。第二步，利用来自癌症基因组图谱（TCGA）数据库的 31 种不同癌症类型的癌症和 NAT 样本，对第一步得到的 DMC 进行进一步筛选。第三步，使用 3 个数据集对确定的候选标记物进行验证。在第一步中，共确定了 2238 个在癌症与正常样本、腺瘤与正常样本比较中都存在的 DMC 位点。其中 75 个基因在 TCGA 的 30 种非结直肠癌癌症中表现为低甲基化。随后，通过 LASSO 回归将数量减少到 8 个。其中 cg14015706 和 cg08247376 这两个位点，分别位于 NTMT1 基因的第一个外显子和 MAP3K14 - AS1 转录起始位点上游 200 个碱基对处，适合用于引物 / 探针设计，并且在三个公开验证数据集中均表现为高甲基化，成为潜在的候选标记物。

为确定这两个候选标记物的临床相关性，研究人员分析了从郑州大学第一附属医院获取的 60 个组织样本和 709 个血浆样本中它们的甲基化状态。本研究遵循机构审查委员会（IRB）制定的伦理标准，并获得了郑州大学第一附属医院 IRB 的批准（编号：2022 - KY - 0631 - 002），每位参与者都签署了知情同意书。该研究是血浆中泛癌 DNA 甲基化检测临床研究（临床试验编号：NCT05685524）的一个子项目。研究人员对 30 个结直肠癌组织样本和 30 个 NAT 样本的 NTMT1 和 MAP3K14 - AS1 目标区域进行亚硫酸氢盐处理后的 Sanger 测序，以确认它们的甲基化状态。结果显示，与 NAT 样本相比，结直肠癌样本中扩增子内的 CpG 位点甲基化频率更高。

为提高候选标记物在血浆中识别低丰度 cfDNA 甲基化信号的能力，研究人员采用了双链和双小沟结合（MGB）探针聚合酶链反应（PCR）方法，即正义 - 反义双 MGB 探针（SADMP）技术。对于 NTMT1 基因，使用两组引物和探针同时扩增亚硫酸氢盐转化后的扩增子区域的正义链和反义链；对于 MAP3K14 - AS1 基因，使用一对引物和两个探针扩增扩增子区域的反义链。标准曲线显示，这两个基因的扩增效率分别为 98% 和 110%，在 95 - 110% 的满意范围内。与单链扩增或使用单个探针相比，SADMP 技术使两个基因的循环阈值（Ct）值提前了一个循环。并且，SADMP 检测对 NTMT1 和 MAP3K14 - AS1 非常灵敏，在没有甲基化 DNA 或存在大量未甲基化 DNA（10⁷ copies/μL）时没有扩增曲线，且能分别稳定检测浓度为 10 copies/μL 和 5 copies/μL 的甲基化 DNA。

随后，研究人员通过 SADMP 方法在 709 名参与者的 2mL 血浆中对这两个生物标志物进行验证。2mL 血浆来源的 cfDNA 经过亚硫酸氢盐转化后用于甲基化特异性 PCR（MSP）。血浆样本来自结直肠癌、晚期腺瘤（AA）、非晚期腺瘤（non - AA）、息肉、肠道疾病（ID）、非消化系统疾病（NDD）、非结直肠癌癌症患者和健康受试者。研究人员将整个数据集按 2:1 的比例随机分为训练集和验证集。首先，通过受试者工作特征（ROC）曲线分析，以结直肠癌和 AA 为阳性样本，其余样本为阴性样本，确定训练集中两个基因的 Ct 值临界值，NTMT1 和 MAP3K14 - AS1 基因的临界值分别为 48.2 和 48.4。当两个基因联合检测时，只要有一个基因呈阳性或两个基因都呈阳性，样本就被视为存在甲基化。按照上述判断标准，双靶点甲基化检测在训练集、验证集和总数据集中的灵敏度分别为 86.4%、81.8% 和 84.8%，显著高于任何一个单靶点检测。特异性方面，NTMT1 为 91.0%，MAP3K14 - AS1 为 92.5%，双靶点为 91.5%。双靶点检测在检测早期肿瘤方面也有效果，对 AA、I 期结直肠癌和 II 期结直肠癌的灵敏度分别为 32.0%、75.0% 和 81.2%。在对 120 个结直肠癌样本进行的 NTMT1/MAP3K14 - AS1 和 Septin9 甲基化检测的对比研究中，NTMT1/MAP3K14 - AS1 的灵敏度（85.8%）显著高于 Septin9（61.7%）。双靶点检测在健康样本中的特异性最高（95.9%），在不同亚组（包括健康个体、NDD、ID 和息肉样本）中表现一致，表明该检测能抵抗多种良性疾病的干扰。

此前有研究报道过 C9orf50 和 MAP3K14 - AS1 单独用于结直肠癌诊断和筛查。在本研究中发现，它们联合检测时灵敏度显著提高，超过了传统的 septin9 检测。血浆 NTMT1/MAP3K14 - AS1 双靶点甲基化检测有望成为结直肠癌非侵入性筛查的新工具。

资助：本研究得到河南省科技项目（编号：232102310028）的支持。
利益冲突：无。