解析人源粪便中两种穆氏人肠微菌（Hominenteromicrobium mulieris）菌株全基因组序列：肠道微生物研究新突破

为深入剖析人类肠道微生物组，来自法国的研究人员运用厌氧条件下基于流式细胞术的物种靶向分选法，对肠道微生物群落展开研究。他们成功分离出两种穆氏人肠微菌（Hominenteromicrobium mulieris）菌株 CIP 112194 和 CIP 112527，并测定其完整基因组序列，这为肠道微生物研究提供了关键数据。

　　人类肠道微生物群主要由专性厌氧菌构成。研究人员采用一种基于在厌氧条件下利用流式细胞术进行物种靶向分选的方法来分析肠道微生物组。本报告阐述了从一名法国健康成年人粪便中分离出的两种穆氏人肠微菌（Hominenteromicrobium mulieris）菌株 CIP 112194 和 CIP 112527 的完整基因组序列。该志愿者为年轻的素食成年人。

为研究微生物群落，相关人员开发了单细胞分配技术，可实现对微观颗粒的无标记分选。基于此方法，已鉴定出 82 种人类肠道细菌菌株，其中包括穆氏人肠微菌（Hominenteromicrobium mulieris）等新物种。本研究报告的两种穆氏人肠微菌菌株 CIP 112194 和 CIP 112527，分离自 “COSIMMGEN J” 辅助队列的人类粪便样本，该队列研究已获相关机构批准。这些菌株是从一名健康志愿者的粪便样本中分离得到的，通过针对两种普拉氏粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）菌群的多克隆抗体进行靶向，并在厌氧条件下利用流式细胞术进行分选。它们在预先还原的胰蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖酵母提取物培养基（添加 0.1% L - 半胱氨酸盐酸盐和维生素）中，于 37°C、严格厌氧条件（5% H₂/5% CO₂/90% N₂）下培养 48 小时。经 16S rRNA 基因测序进一步分析，确定这些分离菌株属于人肠微菌属（Hominenteromicrobium），该属与普拉氏粪杆菌同属颤螺旋菌科（Oscillospiraceae）。

用于 Illumina 和 Nanopore 测序的基因组 DNA，分别从菌株 CIP 112194 和 CIP 112527 的 8mL 过夜培养物中提取，提取时分别使用了 Genomic-tip 100G 试剂盒（Qiagen 公司）和 Nanobind CBB 试剂盒（Pacific Biosciences 公司）。Illumina 测序由微生物共享平台（法国巴黎巴斯德研究所）按照其标准文库制备流程（Nextera 标签化试剂盒，Illumina 公司），使用 Illumina NextSeq 550 设备，采用 2×150bp 协议进行。双端测序读段利用 fqCleanerER v23.12 工作流程进行修剪，要求 Phred 质量分数达到 25 且读段长度≥100 个碱基。同样的基因组 DNA 等分试样也用于长读长测序，使用连接测序基因组 DNA 试剂盒（SQK-NBD114.24，Oxford Nanopore Technologies 公司）。制备文库时，基因组 DNA 无需进行剪切或大小筛选。文库在 MinION Mk1C 设备（Oxford Nanopore Technologies 公司，英国）上，使用 R10.4 流动池（FLO-MIN114，Oxford Nanopore Technologies 公司）进行 48 小时测序，并利用 Dorado v0.3.0 工具进行碱基识别。使用命令行工具 Hybracter hybrid v0.7.3 进行从头组装。利用 Filtlong v0.2.1 对长读长进行过滤和子采样，CIP 112527 的参数为 “--min_quality 10 min_length 10000”，CIP 112194 的参数为 “--min_quality 10 min_length 5000”。最终，CIP 112527 保留了 11389 条读段（175875634bp，N50 为 15403bp），CIP 112194 保留了 41843 条读段（345761802bp，N50 为 8351bp）。使用 Flye v2.9 进行基因组组装，每个菌株均生成一个单一的重叠群，Flye 将其标记为环状。最后，分别使用 pypolca v0.3.1（针对 CIP 112194）和 polypolish v0.6.0（针对 CIP 112527），利用 Illumina 修剪后的双端读段对重叠群进行抛光处理。使用 dnaapler v0.7.0 将重叠群以 dnaA 染色体复制起始基因作为起始进行重定向。

两个基因组组装结果均由一条约 310 万碱基对的环状染色体构成，G + C 含量为 52.4%。通过对穆氏人肠微菌模式菌株 CLA-AAH250（GCF_020687165）的草图基因组与 CIP 112194 和 CIP 112527 的基因组序列进行成对基因组比较，基于 MUMmer 计算得出的平均核苷酸同一性分别为 98.88%（比对核苷酸占 85.37%）和 98.98%（比对核苷酸占 84.03%），这表明这两种菌株属于穆氏人肠微菌物种。

基因组注释采用 NCBI 原核基因组注释流程（2024 年 3 月，版本 6.7）完成。

作者感谢 BIOASTER（巴黎）的塞缪尔?贝莱（Samuel Bellais）在厌氧条件下进行的靶向细胞分选，以及 ICAReb 生物样本库（法国巴黎巴斯德研究所）的雷米?阿蒂斯（Rémy Artus）在获取粪便样本方面提供的帮助。