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本文聚焦麻疹病毒（MeV），其引发的亚急性硬化性全脑炎（SSPE）危害极大且无有效疗法。研究发现，SSPE 患者体内 MeV 的 F 蛋白积累多种氨基酸变化，可介导不依赖 CADM1/2 的膜融合，拓宽触发细胞融合的宿主因子范围，为理解 MeV 神经致病性机制提供重要依据。
### 研究背景
麻疹是一种极具传染性的疾病，由麻疹病毒（Measles virus，MeV）引起。MeV 属于副粘病毒科麻疹病毒属，其包膜上有血凝素（hemagglutinin，H）和融合蛋白（fusion protein，F）。在感染过程中，H 蛋白与免疫细胞上的信号淋巴细胞激活分子家族成员 1（signaling lymphocytic activation molecule family member 1，SLAMF1）和上皮细胞上的 nectin - 4 结合，促使 F 蛋白发生构象变化，从而引发膜融合，使病毒进入靶细胞并实现细胞间传播。
然而，MeV 可能在人体大脑中持续存在，引发亚急性硬化性全脑炎（subacute sclerosing panencephalitis，SSPE），这是一种致命的进行性神经疾病。目前尚无有效治疗方法。野生型 MeV 菌株无法在缺乏 SLAMF1 和 nectin - 4 表达的大脑中传播，但 SSPE 患者体内的 MeV 却能在神经元间扩散。研究发现，SSPE 患者体内 MeV 的 F 蛋白存在一些氨基酸变化，如 T461I，这些变化使其能利用细胞黏附分子 1（CADM1，也称为 IGSF4A、Necl - 2 和 SynCAM1）和 CADM2（也称为 IGSF4D、Necl - 3 和 SynCAM2）作为顺式作用的融合触发分子，在中枢神经系统中传播。不过，SSPE 分离株的 F 蛋白除了这些已知的促融合变化外，还存在其他功能未知的变化。
研究结果
- SSPE 来源的 F 蛋白介导不依赖 CADM1/2 的膜融合：以往研究表明，CADM1 和 CADM2 能触发促融合突变型 MeV F 蛋白（如 F (T461I)）介导的膜融合，但野生型 F 蛋白不行。而来自 SSPE 患者的 F_Patient B 和 F_OSA - 3 蛋白，除了 T461I 替换外，还有其他氨基酸变化。实验发现，当与 H 蛋白在 293FT 细胞中共表达时，F_Patient B 和 F_OSA - 3 不仅在有 CADM1 表达时融合活性增强，而且在无 CADM1 表达时也能诱导合胞体形成，而 F (T461I) 则不能。通过双分裂蛋白（dual split protein，DSP）检测系统量化膜融合水平，结果也证实了 F_Patient B 和 F_OSA - 3 可以不依赖 CADM1 介导膜融合。此外，为排除 293FT 细胞内源性 CADM1 的影响，使用 “CADM 盲” 的 H 蛋白 H (A171 - 175) 进行实验，结果表明 F_Patient B 和 F_OSA - 3 仍能引起细胞融合，进一步支持了它们不依赖 CADM1 介导膜融合的结论。
- F_Patient B 中 G264E 和 T461I 联合替换使膜融合不依赖 CADM1/2：为探究 F_Patient B 中哪些氨基酸变化导致其不依赖 CADM1/2 介导膜融合，研究人员将 F_Patient B 中的氨基酸变化逐一回复为野生型 F 序列，并用 DSP 检测分析膜融合水平。结果发现，当引入 E264G 或 I461T 替换时，膜融合水平显著下降，这表明 G264E 和 T461I 替换对 F_Patient B 诱导不依赖 CADM1/2 的膜融合很重要。实际上，同时具有这两个替换的 F (G264E/T461I) 蛋白在 293FT 细胞中，即使没有 CADM1 表达也能诱导膜融合，而 F (G264E) 和 F (T461I) 则不能。
研究人员还测试了其他宿主分子能否触发 F (G264E/T461I) 介导的膜融合。结果发现，除 CADM1 和 CADM2 外，CADM3、CADM4、nectin - 3 和 CRTAM 也能触发 F (G264E/T461I) 介导的膜融合，而 F (G264E) 或 F (T461I) 介导的膜融合只有 CADM1 和 CADM2 能触发。这表明 F 蛋白中促融合变化的积累使 MeV 能利用除 CADM1/2 之外的宿主分子诱导细胞融合。
进一步研究发现，CADM3 和 CADM4 在反式作用下能触发 F (G264E/T461I) 介导的膜融合，nectin - 3 和 CRTAM 则需要在顺式和反式同时表达时才能触发膜融合。这说明 F 蛋白中累积的氨基酸变化使 MeV 能利用以三种不同方式（顺式、反式、顺反式）起作用的融合触发宿主分子。
3. F_OSA - 3 中 F375S、I446N 和 T461I 联合替换使膜融合不依赖 CADM1/2：对 F_OSA - 3 进行类似研究，将其氨基酸变化逐一回复为野生型 F 蛋白序列，发现当引入 S375F、N446I 或 I461T 替换时，膜融合水平显著降低，表明 F375S、I446N 和 T461I 替换是 F_OSA - 3 诱导不依赖 CADM1/2 膜融合的原因。当与 H 蛋白共表达时，F (F375S/T461I)、F (I446N/T461I) 和 F (F375S/I446N/T461I) 能在 293FT 细胞中诱导不依赖 CADM1 的膜融合，而 F (F375S)、F (I446N)、F (T461I) 和 F (F375S/I446N) 则不能。
研究还发现，不同的突变 F 蛋白介导膜融合时，能触发融合的宿主分子不同。如 F (F375S/T461I) 介导的膜融合可由 CADM1、CADM2、CADM4、nectin - 3 和 CRTAM 触发，而 F (I446N/T461I) 介导的膜融合只有 CADM1、CADM2 和 CRTAM 能触发。这表明在 MeV 持续感染过程中，不同的突变 F 蛋白可能利用不同的宿主分子触发膜融合。
4. F 蛋白中 I446N 替换对 CHO 细胞中不依赖 CADM1/2 的膜融合有抑制作用：上述膜融合实验大多在 293FT 细胞中进行，研究人员也在 CHO 细胞中进行了实验。结果发现，在 CHO 细胞中，F_Patient B 和 F (G264E/T461I) 能诱导合胞体形成，而 F (G264E) 和 F (T461I) 不能，这与在 293FT 细胞中的结果一致。但 F_OSA - 3 及其不同突变组合在 CHO 细胞中的表现与 293FT 细胞不同，F_OSA - 3 在 CHO 细胞中只能诱导小的合胞体，F (F375S/I446N)、F (I446N/T461I) 和 F (F375S/I446N/T461I) 几乎不能诱导细胞间融合。这表明 F 蛋白中 I446N 替换在 CHO 细胞中可能抑制不依赖 CADM1/2 的膜融合。通过构建携带 N446I 替换的 F_OSA - 3 质粒进行实验，结果支持了这一假设，即 F_OSA - 3 - N446I 在 CHO 细胞中诱导的合胞体比 F_OSA - 3 大，而在 293FT 细胞中比 F_OSA - 3 小。
研究人员还检测了 F 蛋白的切割效率和细胞表面表达水平，发现它们与融合活性均无相关性，说明本研究中突变 F 蛋白介导的不依赖 CADM1/2 的膜融合水平可能反映了其在各自宿主细胞中的内在融合能力。
5. F_Patient B 和 F_OSA - 3 中累积的氨基酸变化促进神经元传播：为研究 SSPE 来源的 F 蛋白氨基酸变化对其在神经元中融合活性的影响，研究人员建立了基于原代神经元的融合介导传播检测方法。在 SSPE 患者中，MeV 基因组被认为通过 MeV 糖蛋白介导的突触融合在神经元间跨突触传播。研究人员将编码野生型 H 蛋白、突变 F 蛋白和 mNeonGreen 的 pCA7 质粒转染到小鼠原代神经元中，通过荧光显微镜观察。当神经元发生膜融合时，mNeonGreen 蛋白（可能还有转染的质粒）会从最初转染的神经元扩散到相邻的未转染神经元。通过测量表达 mNeonGreen 的神经元面积来量化神经元间的细胞融合程度。
实验结果表明，在小鼠原代神经元中，与野生型 F 蛋白相比，具有 Patient B 菌株氨基酸变化的 F (G264E/T461I) 蛋白介导的 mNeonGreen 扩散增加；在具有 OSA - 3/Bs/B 菌株氨基酸变化的突变 F 蛋白中，F (F375S/I446N/T461I) 蛋白使 mNeonGreen 扩散增加最多。此外，I446N 替换对 OSA - 3/Bs/B 菌株在神经元中的传播很重要，F_OSA3 - N446I 比 F_OSA - 3 介导的 mNeonGreen 扩散更少。这些结果与在 293FT 细胞中的融合实验数据一致。
讨论
本研究表明，SSPE 患者体内 MeV 分离株中 F 基因的累积突变使其能够以不依赖 CADM1/2 的方式诱导膜融合。F_Patient B 中的 G264E 和 T461I 联合替换以及 F_OSA - 3 中的 F375S、I446N 和 T461I 特定组合足以在无 CADM1/2 表达时诱导膜融合。这些 F 蛋白的氨基酸变化使膜融合可由除 CADM1/2 之外的多种宿主分子触发。
此前研究认为，F 蛋白中的促融合氨基酸替换可使 MeV 利用与 H 蛋白弱相互作用的宿主分子触发融合，可能是通过降低 F 蛋白预融合形式的稳定性，降低诱导其构象变化所需的活化能水平。本研究中的替换位于 F 蛋白的三个特定区域（site I、site II 和 site III），这些区域的突变积累可能进一步降低 F 蛋白的稳定性，使 MeV 能够利用更多与 H 蛋白在顺式和 / 或反式中弱相互作用的非经典宿主分子。
对于一些宿主分子（如 nectin - 3 和 CRTAM）需要在顺式和反式同时表达才能触发膜融合的现象，研究人员提出两种假设机制。一是宿主分子从不同方向（顺式和反式）与 H 蛋白相互作用，可能促进 H 蛋白的构象变化，进而将融合触发信号传递给 F 蛋白；二是 nectin - 3 和 CRTAM 的反式同源相互作用可能产生新的界面，使其能够与 H 蛋白有效相互作用，而仅在顺式或反式起作用的宿主分子即使不在膜的另一侧同时表达，也能与 H 蛋白有效相互作用。
研究还发现，F_OSA - 3 中的 I446N 替换在 293FT 细胞中增加融合活性，但在 CHO 细胞中抑制融合活性，其机制尚不清楚。这表明在研究突变 F 蛋白的融合活性时，评估其在目标细胞类型（如神经元）中的活性很重要，因为突变 F 蛋白在不同细胞类型中可能表现出不同的表型。本研究中使用的基于神经元的融合介导传播检测系统，即使在突变病毒粒子因稳定性低难以回收时，也能评估 MeV 在神经元中的传播，可作为评估其他感染神经元病毒（如 1 型单纯疱疹病毒、亨德拉病毒和尼帕病毒）发病机制的有用工具。
由于 CADM1 和 CADM2 在中枢神经系统中大量表达，MeV 获得利用除 CADM1/2 之外的融合触发分子的能力具有重要意义。虽然单个氨基酸变化（如 T461I）的重组 MeV 能利用 CADM1/2 在神经元中传播并引起神经致病性，但 F 基因的累积突变使 MeV 在神经元中的融合更有效。在持续感染过程中利用更多宿主融合触发分子的能力，可能有助于 MeV 在 SSPE 患者大脑中更高效地传播，使 MeV 进一步适应大脑环境，导致更强的神经致病性，最终危及患者生命。
材料和方法
- 细胞：293FT 细胞用添加 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）培养；稳定表达 DSP1 和 DSP2 的 293FT 细胞在添加 10% FBS 和 1μg/mL 嘌呤霉素的 DMEM 中培养；CHO 细胞用添加 10% FBS 的 RPMI 培养基培养；小鼠原代神经元从胚胎 17 天的 C57BL/6 小鼠海马中分离并按先前方案培养，动物实验遵循相关机构的动物实验指南。
- 质粒：使用真核表达载体 pCA7，构建分别编码 MeV H（Ichinose - B（IC - B）菌株）、MeV F 蛋白（IC - B 菌株）、多种宿主分子、EGFP 等的 pCA7 质粒。为进行 Western blot 检测，在野生型和突变型 F 蛋白的 C 末端融合 FLA
