Far-red fluorescent genetically encoded calcium ion indicators：开拓钙离子成像新视野

《Nature Communications》：Far-red fluorescent genetically encoded calcium ion indicators

在生物学研究中，为解决现有遗传编码钙离子指示剂（GECIs）在波长、亮度等方面的不足，研究人员开展了新型远红荧光 GECIs 的设计与开发研究。结果得到 FR-GECO1a 和 FR-GECO1c，它们性能优异，可用于多色 Ca2+成像等，为相关研究提供了新工具。

　　在生命科学研究的微观世界里，细胞内的钙离子（Ca²⁺）如同一个神奇的信号使者，它的动态变化承载着众多关键信息，对细胞信号传导和神经元活动等过程有着举足轻重的影响。遗传编码钙离子指示剂（Genetically encoded calcium ion indicators，GECIs）作为研究 Ca²⁺动态的有力工具，能够实现单细胞分辨率下的功能成像。然而，现有的 GECIs 却存在着一些令人困扰的问题。

大多数基于绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）的 GECIs，其激发和发射波长较短，在进行深层组织成像时效果不佳，就像是视力不好的人在黑暗中看东西，模糊不清。而且，它们与常用的光遗传学工具光谱重叠，容易产生干扰，这无疑给研究工作带来了诸多不便。此外，近红外 GECIs 虽然光谱合适，但分子亮度较暗，就像一个光线微弱的手电筒，难以照亮研究的细节。因此，开发性能更优、波长更红移的 GECIs 迫在眉睫。

为了攻克这些难题，来自加拿大阿尔伯塔大学、美国哈佛大学、日本东京大学等多个研究机构的研究人员携手合作。他们开展了一项极具创新性的研究，旨在设计和开发新型的远红荧光 GECIs。经过不懈努力，研究人员成功研发出两种远红荧光 GECIs——FR-GECO1a 和 FR-GECO1c。这一成果意义非凡，它们为多色 Ca²⁺成像以及更深层次的组织体内 Ca²⁺成像开辟了新的道路，就像为科研人员提供了一副更清晰的 “显微镜”，让他们能够更深入地探索细胞和组织的奥秘。该研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。在蛋白质工程方面，通过对 mKelly1 和 mKelly2 等远红荧光蛋白进行改造，构建出 FR-GECO1a 和 FR-GECO1c 的初始模型，并利用定向进化技术对其进行优化。在体外表征中，运用光谱分析、钙离子滴定等技术对蛋白的光物理性质、钙离子亲和力等进行精确测定。在细胞和动物实验中，借助细胞培养成像和体内成像技术，在培养的神经元和斑马鱼胚胎心脏等模型上评估 FR-GECO1a 和 FR-GECO1c 的性能 。

蛋白质工程

研究人员起初尝试了两种策略来开发远红 Ca²⁺指示剂。第一种策略是将远红荧光的关键突变嫁接到现有的红色 GECIs 上，但结果令人失望，得到的原型要么完全失去荧光，要么光谱红移不明显。第二种策略是从远红荧光蛋白（FP）支架出发从头设计 GECI，然而基于 mNeptune 和 mCardinal 的初始尝试也未成功，研究人员推测可能是由于钙调蛋白及其结合肽的插入位点与蛋白寡聚化界面重叠，影响了蛋白折叠和发色团成熟。

随后，研究人员将目光转向 mKelly1 和 mKelly2，这两种蛋白是 mCardinal 的远红荧光蛋白变体，具有增强的单体性。他们以 K-GECO1 为起始支架，用 cpmKelly2 替换其环状排列的 FusionRed RFP 部分，并对连接子进行优化，经过多轮定向进化，最终成功获得了 FR-GECO1a。在此基础上，研究人员通过筛选 mKelly1 特异性突变的组合文库，进一步得到了 FR-GECO1c。

体外表征

对纯化后的 FR-GECO1a 和 FR-GECO1c 进行光谱分析发现，它们的激发和发射峰相对于 mKelly2 都有轻微蓝移。在 Ca²⁺结合状态下，二者的单光子分子亮度比 mKelly2 更亮，这得益于量子产率的提高。此外，FR-GECO1a 和 FR-GECO1c 在体外 Ca²⁺饱和状态下，是双光子（2P）激发时最亮的红色 GECIs 之一，其最佳 2P 激发波长范围为 1050 - 1200nm。同时，它们对 Ca²⁺具有较高的亲和力，Hill 系数大于 1，且荧光响应速度快。在 pH 依赖性方面，二者在结合 Ca²⁺后 pK_a会发生变化。在培养的 HeLa 细胞中，两种变体对组胺诱导的 Ca²⁺振荡都有明显响应。

性能在培养神经元中的测试

研究人员将 FR-GECO1a 和 FR-GECO1c 在原代大鼠海马和皮层神经元中表达，以评估其在成像神经元活动方面的性能，并与 jRGECO1a 和 jRCaMP1a 这两种先进的红色 GECIs 进行比较。结果显示，两种指示剂在神经元中的荧光均匀分布于细胞质中，FR-GECO1a 的基础荧光更亮，有助于识别转染细胞和观察神经细胞的精细形态；FR-GECO1c 则在检测单个动作电位时，因其较大的 Ca²⁺依赖性 ΔF/F₀，展现出更好的性能。在给予电场刺激诱发动作电位时，FR-GECO1a 和 FR-GECO1c 都能产生明显的荧光变化，且响应时间和信号噪声比与其他先进的红色 GECIs 相当，表明它们能够灵敏地检测神经元活动。

Ca²⁺光补丁用于斑马鱼胚胎心脏的体内全光学心脏电生理学研究

在斑马鱼研究中，研究人员发现 FR-GECO1 在斑马鱼胚胎心脏中的 Ca²⁺依赖性荧光变化明显大于基于 BV 的近红外 GECIs，且具有更高的信噪比。同时，FR-GECO1a 和 FR-GECO1c 与蓝光激活的通道视紫红质（如 CheRiff）光谱正交性良好，二者共表达时，激活 CheRiff 能产生可靠的 Ca²⁺瞬变，并被 FR-GECO1a 和 FR-GECO1c 有效检测到。在体内实验中，研究人员通过在斑马鱼胚胎中同时表达 FR-GECO1 和蓝光激活的通道视紫红质，实现了对斑马鱼胚胎心脏的全光学起搏和成像，证明了 FR-GECO1a 和 FR-GECO1c 可用于光补丁方法来操纵和成像细胞。

在结论和讨论部分，FR-GECO1a 和 FR-GECO1c 作为新型远红荧光 GECIs，具有诸多优势。它们在 2P 激发下亮度高，能实现更深层次的组织成像，且与蓝光激活的光遗传学工具兼容性好，可用于全光学研究。虽然作为第一代 GECIs，它们还有进一步优化的空间，如提高亮度、优化动力学和调整 pK_a值等，但无疑为 GECI 工具包增添了重要成员。此外，FR-GECO1 的 cpmKelly2 支架还可作为模板，用于开发针对其他配体的远红荧光指示剂，为生命科学研究提供了更广阔的探索空间，有望推动细胞信号传导、神经科学等多个领域的深入发展。