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为解决植物病原菌蛋白质组研究受宿主蛋白干扰的问题，研究人员开展了对灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）时间蛋白质组的研究。他们优化培养基，分析不同阶段蛋白表达，发现多个致病相关蛋白及代谢通路变化，为防治真菌病害提供依据。
灰葡萄孢菌（
Botrytis cinerea）是一种极具威胁的坏死营养型真菌病原体，它就像农业领域的 “隐形杀手”，悄无声息地侵袭着全球范围内的众多农作物，每年给农业经济带来约 1000 亿美元的巨额损失。在过去，虽然科学家们对它展开了诸多研究，试图揭开其致病的神秘面纱，但研究过程困难重重。植物病原菌蛋白质组学研究面临着一个棘手的难题，那就是在提取病原菌蛋白质时，大量的植物蛋白会从中捣乱。植物蛋白酶会无情地降解真菌蛋白，而且植物细胞壁成分、细胞外基质等物质也会阻碍真菌蛋白的有效提取，就连植物中常见的核酮糖 - 1,5 - 二磷酸羧化酶 / 加氧酶（Rubisco）都会掩盖住真菌中含量较少的蛋白，这使得基于质谱的蛋白质组分析难以顺利进行。因此，开发一种能够有效分离植物和真菌蛋白质组，同时又不影响它们之间分子相互作用的研究模型，成为了众多科研人员梦寐以求的目标。
为了攻克这一难题，来自区域生物技术中心合成生物学与生物加工小组以及哈里亚纳中央大学生物技术系的研究人员，展开了一项极具意义的研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为我们深入了解灰葡萄孢菌的致病机制带来了新的曙光。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是菌株培养，他们获取了 5 种灰葡萄孢菌菌株，在特定条件下进行培养并收集孢子 。接着进行致病性测试，通过在番茄叶片和果实上接种孢子，观察感染情况并测量病斑直径。生化分析则用于检测病原菌分泌的致病酶活性。在蛋白质分析方面，采用 TCA / 丙酮法提取蛋白质，通过 BCA 法进行定量，利用 LC-MS/MS 技术结合生物信息学分析，对蛋白质进行鉴定和定量研究。
下面来看看具体的研究结果。
- 比较评估植物致病性：研究人员从多个培养中心获取了不同的灰葡萄孢菌菌株，采用多维分析方法对它们的致病能力进行评估，包括离体叶片试验、果实接种和生化分析等。实验结果表明，在众多菌株中，灰葡萄孢菌 ITCC 6192 脱颖而出，在番茄植株上展现出最强的致病性，因此被选定用于后续研究。
- 优化蛋白质组学实验的琼脂培养基：为了找到更接近植物环境的培养基，研究人员精心制备了多种不同成分的测试琼脂平板，分别接种 ITCC 6192 菌株的孢子，在特定条件下培养后提取真菌蛋白，再通过质谱分析。结果显示，含有 20% 番茄提取物和 2% 脱蛋白植物提取物的培养基 C 表现最为出色，它不仅检测到的蛋白数量最多，而且与体内感染样本的蛋白质相关性最高，还能促进总蛋白和植物细胞壁降解酶的分泌，因此被用于后续的时间进程实验。
- 灰葡萄孢菌阶段特异性差异蛋白质组表达：研究人员利用无标记定量蛋白质组学技术，对感染后 12、36、72 和 120 小时的真菌蛋白进行分析。总共鉴定和定量了 3244 种蛋白质，其中 2045 种存在差异调节。主成分分析（PCA）和层次聚类结果表明，不同时间点的蛋白质表达模式差异明显。在感染早期，参与细胞壁降解、抗氧化等过程的蛋白质大量表达，比如糖苷水解酶、果胶酯酶、过氧化氢酶等，这些蛋白有助于病原菌突破植物防线并建立感染。而在感染后期，参与大分子合成、嘌呤和碳水化合物代谢等途径的蛋白表达上调，同时许多参与碳水化合物水解的基因表达下调 。
- 基因本体和网络分析：通过基因本体（GO）分析发现，在 120 小时时，下调的蛋白主要富集在碳水化合物衍生物结合、ATP 结合等类别，参与翻译、大分子生物合成等过程的蛋白表达下调；而 72 小时时，上调的蛋白则富集在翻译、有机氮化合物代谢等过程。对后期下调的蛋白进行 STRING 分析，发现水解酶类（尤其是糖苷酶）在网络中占据重要地位，它们在病原菌穿透植物宿主过程中发挥关键作用。
综合来看，这项研究成功开发并优化了用于植物病原真菌蛋白质组学研究的培养基，全面揭示了灰葡萄孢菌在感染过程中的蛋白质组动态变化。研究不仅验证了一些已知致病因子的作用，还发现了 Rho GTP 酶、Rho GEF 蛋白等新的效应蛋白。不过，这些新蛋白的精确分子功能、相互作用及调控途径仍有待进一步研究。但不可否认的是，该研究成果为深入理解灰葡萄孢菌的致病机制提供了重要依据，也为开发更有效的防治真菌介导的植物病害策略奠定了坚实基础。
