双色荧光转录因子活性传感器dFLASH：组蛋白整合活细胞报告系统助力高通量筛选与功能基因组学研究

编辑推荐：研究人员针对活细胞转录因子(TF)活性监测技术存在的模块化不足、信号噪音比低等问题，开发出基因组整合型双荧光报告系统dFLASH。该系统通过HIF-1α、PGR等通路验证，实现Z'值0.61-0.74的高通量筛选性能，成功应用于CRISPR全基因组敲除筛选和1600种天然产物库的药物发现，为合成生物学和疾病机制研究提供强大工具。

　　在细胞信号转导与基因调控网络中，转录因子(TF)作为环境刺激与遗传输出的核心枢纽，其活性异常与癌症等疾病密切相关。然而现有TF报告系统普遍存在信号噪音比低、缺乏内参校准、应用场景单一等问题，严重制约了其在合成生物学构建、药物筛选和功能基因组学研究中的广泛应用。

澳大利亚阿德莱德大学的研究团队通过巧妙设计，开发出名为dFLASH（dual FLuorescent transcription factor Activity Sensor for Histone-integrated live-cell reporting）的革命性报告系统。这项发表在《Nature Communications》的研究通过将TF响应元件与组蛋白整合型双荧光标记相结合，成功构建了兼具高灵敏度和稳定性的模块化报告平台。该系统不仅能实时监测内源性HIF-1α和PGR通路活性，还可用于合成转录因子（如Gal4DBD-HIFCAD）的功能分析，为生命科学研究提供了多功能工具箱。

研究团队采用三项关键技术方法：1）优化设计的慢病毒载体系统，包含TF响应型Tomato报告基因与组成型EGFP内参的双荧光表达框架；2）基于高内涵成像（HCI）和流式细胞术的多模态检测体系；3）全基因组CRISPR敲除筛选与天然产物库的高通量药物筛选平台。实验使用HEK293T、HepG2、T47D等细胞系及小鼠颗粒细胞原代培养模型进行验证。

在"Design of dFLASH, a dual fluorescent, live cell sensor of TF activity"部分，研究人员通过12个HIF响应元件(HRE)与不同启动子组合的优化测试，最终确定PGK/CMV启动子驱动的mnucTomato-HSVtK-Neo报告基因架构，在HEK293T细胞中实现DMOG诱导下56%的响应率。独特的3xNLS核定位信号设计使单细胞核分割分析成为可能。

"dFLASH senses functionally distinct TF activation pathways"章节展示了系统的广泛适用性。在T47D细胞中，孕酮反应元件(PRE)-dFLASH对R5020的EC₅₀为1.3 nM，且特异性响应孕激素而非雌激素或雄激素；而合成的Gal4RE-dFLASH系统成功监测到FIH酶活性对HIFCAD的调控，证实其可拓展至合成生物学应用。

"Monoclonal dFLASH cell lines confer robust screening potential"部分显示，单克隆化使HEK293T dFLASH-HIF细胞响应率提升至95%，Z'值达0.74。时间分辨率达15分钟的活细胞成像揭示，R5020诱导的PGR激活在6小时内即可检测，而HIF通路响应需10小时，为动态研究提供新视角。

在功能基因组学应用中，"dFLASH-HIF CRISPRi-perturbations"实验证实CRISPRoff介导的VHL敲降可激活报告系统；而"High performance inducible whole genome pooled CRISPR screens"则通过Brunello文库筛选出501个（U2OS）和522个（HEK293T）HIF调控基因，远超既往报道的36个靶点。

药物发现方面，"dFLASH facilitates bimodal screening"采用先激活后抑制的双模式筛选策略，从1600种化合物中鉴定出新型HIF-1α激活剂RQ200674（通过铁螯合机制）和抑制剂RQ500235（下调HIF1A mRNA）。其中Celastarol和Flavokawain B的验证重现了已知抗HIF活性，证实系统可靠性。

这项研究的突破性在于：1）首创组蛋白整合型双荧光报告系统，通过同一位点的EGFP内参实现数据标准化；2）模块化设计支持HIF、PGR等多种TF通路的即插即用；3）Z'值0.61-0.74的高稳定性满足工业级筛选需求；4）成功整合CRISPR筛选与药物发现工作流程。dFLASH系统不仅为基础研究提供强大工具，其发现的新型HIF调节剂更为缺血性疾病和癌症治疗带来新希望。未来通过增强型启动子设计和初级细胞适配，该系统有望在个性化医疗和细胞治疗等领域发挥更大价值。